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  药物分析杂志   2019, Vol. 39 Issue (10): 1792-1799.  DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.10.07
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综述专论

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王香, 金炀, 赵姗姗, 王超越, 孙文宇, 童胜强. 二维逆流色谱技术研究进展[J]. 药物分析杂志, 2019, 39(10): 1792-1799. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.10.07.
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WANG Xiang, JIN Yang, ZHAO Shan-shan, WANG Chao-yue, SUN Wen-yu, TONG Sheng-qiang. Two-dimensional counter current chromatography-advances of recent technologies and key issues[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2019, 39(10): 1792-1799. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.10.07.
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第一作者

王香, Tel:19857106220;E-mail:1093220616@qq.com

通信作者

童胜强, Tel:(0571)88320984;E-mail:sqtong@zjut.edu.cn

文章历史

收稿日期:2019-02-21
二维逆流色谱技术研究进展
王香 , 金炀 , 赵姗姗 , 王超越 , 孙文宇 , 童胜强     
浙江工业大学药学院, 杭州 310014
摘要:一维色谱因其有限的峰容量和相对较低的分离效率而无法一次将目标组分从复杂样品中分离出来。二维色谱因具有峰容量高,分辨率强,进样量大以及选择性强等特点而在天然产物、蛋白质等多组分分离中得到广泛应用。二维逆流色谱(2DCCC)研究目前主要包括在线或离线模式下逆流色谱-逆流色谱联用(CCC-CCC)、逆流色谱-液相色谱联用(CCC-LC),聚焦于2个维度色谱柱的快速选择、溶剂系统的最优条件确定以及与其他技术的联合使用等问题。相比于传统二维LC,CCC与LC的联用在流动相溶剂系统兼容性、正交性程度、纯化能力方面均显示出更大的优势。本文综述了近年来2DCCC技术最新应用研究进展,对关键问题和理论进行了分析,并对2DCCC技术的发展趋势进行展望。
关键词二维色谱    逆流色谱    液相色谱    正交性    在线模式    离线模式    联用技术    
Two-dimensional counter current chromatography-advances of recent technologies and key issues
WANG Xiang, JIN Yang, ZHAO Shan-shan, WANG Chao-yue, SUN Wen-yu, TONG Sheng-qiang    
College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology University, Hangzhou 310014, China
Abstract: One dilemma of one-dimensional chromatography is its restriction in separating target components from the complex samples within one time due to its limited peak capacity and low resolution.The two-dimensional counter current chromatography (2DCCC)owns the merits of high peak capacity, high resolution, large loading capacity and large range of selectivity and has been widely applied in isolating multiple components from natural products, proteins or other complex samples.Two-dimensional counter current chromatography (2DCCC)studies currently include countercurrent chromatography-countercurrent chromatography (CCC-CCC)and countercurrent chromatography-liquid chromatography (CCC-LC)in on-line or off-line mode, focusing on two dimensional columns, the determination of optimal conditions for solvent systems, and coupling with other technologies.Compared with traditional two-dimensional LC, the combination of CCC and LC shows greater advantages in mobile phase solvent system compatibility, degree of orthogonality, and purification ability.This article reviews the recent application research progress of 2DCCC technology, analyzes the key issues and theories, and forecasts the development trend of 2DCCC technology.
Keywords: two-dimensional chromatography    counter current chromatography    liquid chromatography    orthogonality    on-line mode    off-line mode    coupling technologies    

二维色谱是利用2种性质不同并且具有相互独立分离模式色谱柱,第一维色谱柱可以是1根或者是多根分离模式相同的色谱柱串联;第二维色谱柱可以是1根,也可以是多根相同或不同分离模式的色谱柱并联。收集第一维色谱柱流出的组分,手动或自动富集、浓缩或切割后进入第二维色谱柱及检测器,从而在复杂样品组分中实现目标样品的分离纯化。

逆流色谱(countercurrent chromatography,CCC)或离心分配色谱(centrifugal partition chromatography,CPC)又称液-液分配色谱,是指采用两相互不相溶的液体体系分别作为固定相和流动相,溶质在两相中分配分离[1]。CCC与传统的色谱技术相比,具有负载能力大,回收率高,溶剂用量少,易放大等独特优势,它使用2种不相溶的溶剂作为固定相和流动相,可以避免样品在固定相上的不可逆吸附,避免样品变性、失活以及损失等。在整个洗脱过程中,样品随流动相在柱中与固定相不断的接触和分配,从而使样品中各组分达到良好分离[2]。目前主要应用于天然产物、生物制品的提纯[3-4],近年来关于CCC应用的大量工作均是围绕在溶剂系统的优化、洗脱模式的叠加与替换以及普通CCC基础上发展而来的pH区带CCC等[5-7]

二维逆流色谱(two-dimensional counter current chromatography,2DCCC)是指在CCC柱与其他类型的色谱柱构成的二维分离体系中,以CCC为第一或第二维度,通过在线或离线模式,从复杂的天然产物或生物大分子中分离纯化目标组分。2DCCC因其具有高选择性,无不可逆吸附,样品负载量大等特点广泛应用于天然产物领域[8]。近年来,为了提高分离效率和检测潜力,在2DCCC系统装置的改进、溶剂系统的优化以及各种联用策略的运用方面做了大量工作[9-10],根本目的都在于改善二维逆流分离技术,使其在合理的时间内能够提供更大的峰值容量来提高分离效率。要充分利用2DCCC的分离潜力,保证每个维度中使用的分离机制相互独立是非常重要的。本文主要总结了近年来2DCCC关键技术发展、分离条件优化以及2DCCC系统的正交性评价。

1 主要技术与理论问题 1.1 正交性

关于色谱系统正交性的评价方法有很多,但是对于正交性的定义并没有统一的规定,通常,如果在2个维度上采用的分离机制是相互独立的,其中一维和二维的保留时间可以认为是统计独立的,2个系统之间存在正交性是因为2个维度提供了不同的选择性[11]。正交性越高,系统的分离能力就越好。尽管正交性的概念非常重要,但是很少有文献从正交性的角度来探讨2DCCC峰容量以及分辨率的提高。

在以CCC-LC模式构建的二维分离中,一般认为如果采用的2种分离机制是互相独立的并且具有不同的保留曲线,或者说具有不同的选择性,则认为该二维分离是正交的。CCC与LC在分离机制上存在较大的差异,CCC-LC/CCC-CCC相比于LC-LC理论上应具有更显著的正交性。但是正交性不仅取决于分离机制,而且依赖于溶质的性质以及分离条件,比如分子大小、电荷、极性以及疏水性大小等。在实际操作中,CCC两相溶剂体系的多样化与LC柱固定相或流动相的选择,使得溶质在色谱柱内保留机理的相关性达到最小,即正交最大化。正交性的测量和优化的方法有:1995年,Liu[12]等人基于二维分离的影响因素首次分析开发了一种几何方法,开始讨论分离机制、溶剂组成以及分离条件对正交性的影响,之后逐渐发展的应用于色谱正交性评价的信息理论法、格子计数法、凸壳测定法、最邻近距离法和星号方程法等[13-17],通过对保留数据的归一化处理得到二维线性相关图,可以从视图中直观地看出2个维度的相关性,从而迅速判断出2个维度的正交程度。但这些方法存在峰沿一个方向聚集以及对分离空间峰的数量存在依赖性等问题,导致正交性模拟图与实际情况存在一定的偏差,从而对正交性评价产生一定影响。

2017年,Marlot等[18]建立的第1个用于评价2DCCC正交性的体系,没有采用对保留时间进行归一化处理的方法,而是通过在第一维和第二维图中绘制分配系数Kd值(HPLC的保留因子k值)来消除不同维度柱尺寸和操作条件的变化带来的影响。从图 1中可以看出,如果二维分离的相关性很强,那么在第一维色谱柱中的极性相近组分在第二维色谱柱中中仍然无法分开,导致制备色谱仍旧保持一个低的峰容量。相反,如果2个维度没有相关性,利用第一维色谱柱分离可以得到重叠化合物的高浓缩馏分,第二维色谱柱将分离共洗脱化合物。

(a)强相关系数r2(strong correlation coefficient r2)(b)低相关系数r2和低利用二维空间(low correlation coefficient r2 and low utilization of the 2D space)(c)低相关系数r2而未优化2D空间(low correlation coefficient r2 without optimized utilization of the 2D space)(d)低相关系数r2和优化2D空间(low correlation coefficient r2 and optimized utilization of the 2D space) 图 1 二维分离的二维正交示意图[18] Fig.1 2D orthogonality representation of two-dimensional separations[18]
1.2 传统二维色谱中的主要问题

传统的二维液相色谱分离模式包括离线模式LC-LC或在线模式LC×LC,虽然通过2个维度色谱柱的串并联使得整个体系的峰容量增加,分辨率增强,但所存在的问题是不容忽视的。比如:①样品的不可逆吸附性导致样品无法完全注入第2维色谱柱进行分析从而导致样品的丢失,②2个维度流动相的不兼容,③样品过载会造成峰的畸变,④用于制备规模上的成本高等问题。

2018年,Marlot等[19]探讨了CPC作为第一维度应用在二维色谱中的问题。在离线全二维CCC分离中对CPC与制备型高效液相色谱(Pre-HPLC)作为第一维柱选择上做出比较,建立二维等高线图,通过理论峰容量以及分离空间中组分分布的选择性来对这2个系统作出评价。虽然LC×LC的耦合具有强大的峰容量和分辨率,但是2个体系之间存在溶剂兼容性问题,需要花费大量的成本来解决,并且在全二维模式下转移样品,没有考虑到一维Pre-HPLC柱的不可逆吸附导致样品丢失等问题。

而CPC因其液-液组成的特殊化学性质而具有很广的选择性,溶剂系统的微调选择性,液体固定相不存在不可逆吸收,从而实现样品转移的零丢失;CPC中样品的稀释度高可以避免过载问题,使样品在色谱柱中的二维分离易于进行;另外CPC与HPLC因为分离机制不同,从而可以获得更高的正交性,为稀有样品的二维制备分离的开发提供了更多的可能性。Agnès等[20]迅速采用制备型全二维CPC-HPLC用于生物质快速热解析油分析,成功分离生物油中260多种组分。

2 应用情况 2.1 离线2DCCC

CCC的独特优势使得CCC技术作为二维分离中的第1个维度,无论是与另1个CCC技术还是与LC技术相结合,都具有很强的适用性[21]。二维分离可以在线实现,也可以离线实现。离线2DCCC因其经济简便,可操作性强,不用考虑复杂的接口问题,相比于在线模式,目前在生物大分子、复杂天然产物的成分分离中应用更加广泛。

2.1.1 CCC-CCC

2013年,Chen等[21]首次应用CCC-CCC从牛蒡子中分离纯化牛血清白蛋白结合物,在第一维和第二维中采用相同的溶剂系统可以起到延长色谱柱的作用,虽然这个方法可以增加分离因子,但是2个色谱柱的分离机制相同,从正交性方面来看,这个分离系统并不能被视为二维分离。此后,该课题组通过对2个维度使用不同的溶剂体系以及加入金属络合离子,对溶剂系统不断优化来提高峰容量和2个维度的正交程度,但是2个维度均使用CCC柱,分离机制相同且柱效较低,二维分离纯化能力能够进一步提高[22-23]。2018年,Rho等[24]采用离线二维高效CCC技术,2个维度采用2个完全不同的溶剂系统,并且加入酸进行分步洗脱,极大增加了2个维度的选择性以及正交性,使用该方法首次从菟丝子中分离出麦芽糖醇。

2.1.2 CCC-HPLC

CCC具有强大的负载能力,HPLC具有很高的柱效,2个维度的联用可以获得高正交性、高分辨率的制备型二维分离体系。Zhu等[25-26]通过将回收溶剂蒸发至干燥或过滤等方法来消除2个维度之间溶剂体系的兼容性问题,提高系统的分辨率和正交程度。Yoon等[27-28]通过对溶剂系统的不断优化,发现二氯甲烷-甲醇-异丙醇-水(9:6:1:4)的CCC溶剂系统联合HPLC梯度洗脱适用于从麦冬等中草药中富集三叶皂苷。2018年,Rho等[29]采用高效CCC与RP-HPLC结合的方法,从山茶花种子中分离9种新型三萜皂苷。第一维度采用二氯甲烷-甲醇-异丙醇-水(9:6:1:4)的溶剂体系用于富集皂苷提取物,可以得到不同类型的含糖皂苷,然后通过RP-HPLC梯度洗脱连接高分辨质谱,快速分离并鉴定第一维度所得组分,由于2个维度的分离机制完全不同,且溶剂体系也不相同,整个体系的正交程度高,皂苷提取物得到了很好的分离。

对于2DCCC的正交性评价是通过分析型仪器测得数据进行的,分析型目的在于要在最短的分离时间、最大的分离空间中分离出所有化合物,通过样品的实际峰容量和正交性程度来对二维分离体系进行评估。然而制备型色谱的目的是尽可能大地占据二维分离空间且在空间中均匀分布,以满足2个化合物的分离纯度要求和回收要求。峰的聚类是制备色谱发展要考虑的关键因素,而时间限制则不是主要因素,因此对于制备型的2DCCC评价,从分析型的角度来评价是不够准确的。

Marlot[30]建立制备型2DCCC纯化能力以及正交性评估方法,从分离空间峰的占有率和峰值扩散的均匀性以及二维系统的负载能力等方面来评估二维分离体系的纯化能力,通过建立4个CPC柱和2个HPLC柱模拟来比较不同系统条件下组分的分离能力以及不同柱组合之间的纯化能力,相比于传统的基于分析型二维分离所对应的保留指数经归一化处理所得的二维视图,制备型二维分离峰扩散的均匀性及其较强的负载能力,对分离空间占有率的二维视图的选择性效果更加直观,可以通过更少的实验次数来评估制备型2DCCC的分辨率和纯化能力,从而快速对二维色谱柱进行合理选择。

总体上来说,CCC技术作为二维分离中的一个维度,使得2个维度的分离机制更加不同,分离系统具有更高的峰容量,化合物的组分可以得到更好的分离。然而,离线分离模式仍旧存在诸多缺陷,例如耗时长,难以实现自动化,重复性差,容易造成样品丢失和污染。

2.2 在线2DCCC

与离线模式相比,在线分离需要特殊的设备和技术连接,经一维色谱柱所得的组分通过开关阀、样品环以及固相捕集柱等接口技术与第二维色谱柱进行连接,使得分离速度更快,可重现性更好,不会产生样品污染。从1998到2015年,二维逆流色谱耦合(CCC×CCC)分离技术的发展工作侧重于在系统装置方面进行研究与优化;从2015年到2018年,溶剂系统的选择与优化,各种洗脱模式的结合以及洗脱模型的提出,使2DCCC在中药材、生物活性成分方面的制备分离的应用更加广泛。然而,关于2DCCC系统正交性评价模型的建立却很少,无法为全二维分离提供一个度量标准。

2.2.1 在线CCC×CCC关键技术 2.2.1.1 开关阀

开关阀的作用是通过阀门转换(如图 2)直接将组分从一个维度色谱柱转移到另一个维度的色谱柱,这个接口的关键点在于考虑溶剂的合理选择性及兼容性问题。

图 2 使用六通阀作为在线二维CCC × CCC设备接口 Fig.2 Online two dimensional CCC × CCC instruementation using a six-port switching valve as interface

第1个研究开关阀的在线CCC分离由Ito等[31]在1998年进行,第一维色谱柱和第二维色谱柱采用相同的溶剂体系,开关阀的连接只能起到色谱柱的延长作用,并没有达到真正意义上的二维分离。之后该课题组[32-34]通过溶剂系统的调整与改变不断优化分离条件,二维分离的正交性理论上有所提高。Chen等[35]运用六通阀接口技术设计制作的实验室型在线2DCCC仪,结合超滤HPLC靶向引导分离黄蜀葵中α-淀粉酶抑制剂,最终加上推挤洗脱实现目标产物分离。在使用开关阀作为2个维度色谱柱的接口技术时,由于第二维度固定相的液体流动性,大量第一维色谱柱中流动相的转移影响了第二维色谱柱的稳定性,大大减少了二维溶剂体系的选择。因此,这种接口技术的使用,并不能充分利用二维CCC技术分离潜力。其他新型接口技术的发展,以及其他色谱柱接口与开关阀的联用可以将开关阀作为辅助工具实现2个维度的自动连接。

2.2.1.2 样品环

与开关阀一样,样品环也可以作为在线2DCCC分离柱的接口,用以精确控制转移组分的体积。Pan等[36-37]通过样品环和3个三通阀精确转移第一维色谱柱所分离出的组分进入第二维色谱柱进行分离,因为转移体积占第二维色谱柱体积的比例较小,一定程度上可以降低2个维度溶剂兼容性的问题,但该种方法适用于中心切割收集目标组分,在样品切割时会造成其他未知组分丢失而难以运用于全二维模式,不符合全二维分离的目的与要求。

2.2.1.3 固相捕集柱

固相捕集柱是实现在线2DCCC分离的常用接口之一。这种接口能够完全消除第一维色谱柱中的流动相和溶质在第二维柱中的不兼容作用,并且避免大量一维色谱柱中的溶剂的注入第二维色谱柱。Pan等[38-39]在运用在线CCC×CCC二维分离中采用固相捕集柱接口,通过1个六通阀、1个四通阀、1个固相捕集柱以及增加1个补给泵,通过阀门切换,将第一维色谱柱中分离所得的目标组分运送到捕集柱,通过给补充泵加入水,增加目标组分在捕集柱上的分析物的保留。然后冲洗柱子、氮气干燥除去其他残留的溶剂,将捕集到的组分用第二维度的流动相反冲洗到第二维色谱柱中进行洗脱,同时第一维色谱柱中的洗脱仍在进行。水和氮气的冲洗能够确保没有残余溶剂从一个维度色谱柱传至另一个维度色谱柱中,但是可能会存在组分在固相捕集柱中发生降解或者不可逆吸附。之后,该课题组又采用2根固相捕集柱的方法来解决第一维色谱柱中组分洗脱和第二维色谱柱中组分分离的时间差问题,实现真正意义上的具有正交性的二维分离。

固相捕集技术允许二维分离使用2种化学上不同的两相溶剂系统,而不受任何相扰,从而使分离机制完全独立,提高了选择性和正交性。

2.2.2 在线CCC×HPLC关键技术

由于CCC是低压色谱,而HPLC是高压色谱,2个维度色谱柱之间压力的不同,需要1个合适的接口进行衔接。CCC×HPLC技术与CCC×CCC技术所使用接口的类型都包括开关阀、样品环以及固相捕集柱。其不同点在于2个体系的分离机制不同,CCC×HPLC技术在溶剂系统选择方面与色谱柱接口技术的处理方面做了更深入优化[40-43],比如动态混合器和补充泵的加入,采用编程控制的洗脱模式等。

2.2.2.1 开关阀与样品环

第1次应用CCC×HPLC技术的是Wu团队[40],2个维度之间采用的也只是1个单一的六通阀进行衔接,但是在溶剂系统选择方面创新性地使用了单组分有机/含盐水溶液萃取逆流色谱溶剂系统,其中有机相作为固定相,盐水溶液的下相作为流动相,只含有少量的有机溶剂,这将使有机溶剂在连续分离中的使用最小化。该体系采用2个完全不同的分离机制和溶剂系统,虽然是CCC与HPLC耦合的第1次提出,整个二维分离体系具有高正交性,但是只单一使用开关阀或样品环为作为接口仍旧存在2个维度溶剂体系的兼容性问题,因此固相捕集柱作为一种新的接口技术逐渐发展与应用。

2.2.2.2 固相捕集柱

CCC×HPLC的固相捕集柱[41-43]接口相比于CCC×CCC的固相捕集柱接口,加入了动态混合器,然后通过补充泵加水进行稀释,降低溶剂强度以降低2个维度溶剂的兼容性问题,之后又通过洗脱液稀释和湍流混合接口技术,对来自第一维度的溶剂进行稀释。针对实验过程中的时间差问题,采用“走走停停(stop and go)”的编程控制洗脱模式,采用2根捕集柱模式,第一捕集柱上的CCC组分在进行LC分析时,可以将第2个CCC组分转运至第二捕集柱,而无需停止CCC洗脱。

2个维度的不同分离机制以及溶剂兼容性、时间兼容性等传统问题的解决,使得这种新型二维CCC×HPLC系统具有高效、高产的特点,适用于从复杂天然产物中制备、提取和纯化多种目标组分。

3 总结与展望 3.1 总结

2DCCC分离涉及到不同的分离机制,由于2个维度之间可能存在选择性差异,在进行设备改进、溶剂优化、洗脱方式改变的同时,应该考虑2个维度溶剂体系、流动相、分离速度、样品量的兼容性问题,二维接口技术以及正交程度等问题。

目前很多二维分离仍旧局限于中心切割模式的目标组分的分离,想要进行复杂化合物的多组分研究和新化合物的发现,应当考虑全二维模式;2DCCC的应用主要集中在离线方面,尤其是制备型离线2DCCC的发展愈来愈活跃,相应的关于制备型2DCCC纯化能力评价体系的构建刻不容缓。在线2DCCC接口技术还需进行更深入的研究来提高其使用可行性。

3.2 展望

与传统二维色谱技术相比,2DCCC具有一定的优势:比如,关于流动相兼容性,由于CCC属于液-液分配色谱,洗脱模式灵活多样,CCC-LC的溶剂体系相对于传统二维液相色谱LC-LC或LC×LC来说,兼容性更强,CCC×LC更容易实现联用。以CCC常用的两相溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水和LC的2类常用流动相水-甲醇/水-乙腈为例,同一溶剂体系在CCC中通过头-尾洗脱或尾-头洗脱就能实现反相洗脱(下相水相为流动相)或正相洗脱(上相有机相为流动相),上述洗脱模式在第一维色谱即CCC分离中通过调节溶剂体系的比例对色谱分离度影响较小,但是可以较为方便的实现与第二维色谱即LC流动相的兼容性问题。

二维色谱CCC-LC分离中的正交性成为在线/离线联用过程中最值得研究的核心问题,通过从正交性角度的考虑来优化发展在线与离线2DCCC分离技术,更大程度上发挥2DCCC在制备分离方面的潜力,从而能够以最少的试验次数迅速为天然产物、生物制品或其他物质复杂组分的制备分离确定一个更合适、选择性更好的分离体系。

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