2019, Vol. 39 
表1(Table 1)
2. 中国食品药品检定研究院, 北京 100050
2. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China
沉香化气丸收载于《中华人民共和国药典》2015年版一部，由沉香、木香、广藿香、醋香附、砂仁、陈皮、醋莪术、六神曲（炒）、炒麦芽、甘草共10味药经粉碎、泛丸、干燥制成，具理气疏肝及消积和胃之功效，用于肝胃气滞，脘腹胀痛，胸膈痞满，不思饮食，嗳气泛酸[1]。《中华人民共和国药典》2015年版采用显微鉴别法对醋香附、沉香等8药味进行了鉴别，采用TLC法对广藿香、醋香附2药味进行了鉴别，采用HPLC法测定了陈皮中橙皮苷的含量。仅以单个指标性成分橙皮苷的含量来衡量沉香化气丸的质量有失偏颇。
中药复方作为一个有机整体，其多成分的特性决定了单一的指标性成分难以反映中药所体现的整体疗效。中药对照制剂采用道地、优质、规范加工的原料药材（饮片）和辅料，严格按照制法和生产工艺规程，并遵循药品生产质量管理规范制备，用于中成药的质量控制，评价产品投料的真实性与可靠性，具有化学信息丰富，价格低廉，稳定性好，具备指纹/特征图谱特性等优点，能够体现中成药的“配伍环境”和“化学轮廓”[10-11]，为进一步建立药品质量评价新模式提供客观依据。为全面控制沉香化气丸的质量，本文参考了文献[2-9]，以对照制剂作为随行对照，采用GC、HPLC、UPLC法，建立沉香化气丸多组分的含量测定方法。
1 仪器与材料岛津公司LC-20A高效液相色谱仪，LC-30AD超高效液相色谱仪，GC-2010气相色谱仪；Millipore公司Milli-Q型超纯水仪；昆山超声波仪器有限公司KQ-300DE型超声波清洗器；Sartorius公司CP225D型十万分之一电子分析天平。
乙腈为色谱纯（Honeywell公司），甲醇、甲酸、乙酯乙酯为分析纯（广州化学试剂厂），水为超纯水。对照品乙酯龙脑酯（批号110759-201105，含量99.6%）、百秋李醇（批号110772-201407，含量99.9%）、去氢木香内酯（批号111525-201510，含量99.7%），沉香四醇（批号111980-201501，含量96.8%）、甘草苷（批号111610-201106，含量93.7%）、橙皮苷（批号110721-201316，含量95.3%）、甘草酸铵（批号110731-201418，含量93.1%）、木香烃内酯（批号111524-201509，含量99.0%）、广藿香酮（批号111822-201102，含量100%），均购于中国食品药品检定研究院；对照品芸香柚皮苷（批号MUST-16030408，含量99.2%）和吉马酮（批号MUST-15051913，含量99.52%），购于成都曼思特生物科技有限公司。
沉香化气丸对照制剂由广东省药品检验所委托有多年生产丸剂经验的企业，足量优质原料投料，规范生产，并按该对照制剂的标定标准，鉴别、检查、含量测定、均匀性、稳定性等项目符合规定。
4家生产企业的37批沉香化气丸为2016年国家药品监督抽验样品，样品信息见表 1（按国家药品抽验管理规定，厂家名称以代码表示）。
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表 1 沉香化气丸样品信息 Tab.1 Sample information of Chenxiang Huaqi pills |
精密称取乙酸龙脑酯对照品0.135 00 g，置50 mL量瓶中，加乙酸乙酯使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得乙酸龙脑酯对照品溶液；分别精密称取百秋李醇对照品0.012 99 g，吉马酮对照品0.011 06 g，去氢木香内酯对照品0.014 73 g，置10 mL量瓶中，精密加入上述乙酸龙脑酯对照品溶液2 mL，再加乙酸乙酯使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得乙酸龙脑酯、百秋李醇、吉马酮、去氢木香内酯质量浓度分别为0.537 8、1.297 7、1.100 7、1.468 6 mg·mL-1的混合对照品储备液。
2.1.2 供试品溶液及对照制剂溶液的制备取供试品或对照制剂适量，研细，取约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯15 mL，称量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）1 h，放冷，再称量，用乙酸乙酯补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.1.3 色谱条件采用DB-17毛细管柱（30 m×0.25 mm，膜厚度为0.25 µm），柱温为程序升温（初始温度100 ℃，以0.75 ℃·min–1的速率升温至150 ℃，再以3 ℃·min–1的速率升温至200 ℃，保持20 min），进样口温度为200 ℃，检测器（FID）温度为250 ℃，分流比为5:1。混合对照品溶液、供试品溶液和对照制剂溶液的气相色谱图见图 1。
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1.乙酸龙脑酯（bornyl acetate）2.百秋李醇（patchouli alcohol）3.吉马酮（germacrone）4.去氢木香内酯（dehydrocostus lactone） A.混合对照品溶液（mixed reference substance solution）B.供试品溶液（test solution）C.对照制剂溶液（reference drug solution） 图 1 气相色谱图 Fig.1 GC chromatograms |
取混合对照品储备液，采用倍比稀释，配制成乙酸龙脑酯、百秋李醇、吉马酮、去氢木香内酯浓度范围分别为0.17~537.8、0.42~1 297.7、0.35~1 100.7、0.47~1 468.6 μg·mL-1的6个浓度点系列混合对照品溶液，按“2.1.3”项色谱条件进样测定，以对照品质量浓度X（μg·mL-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得到各组分的回归方程及相关系数。结果见表 2。
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表 2 4个成分的回归方程、相关系数（r）及线性范围 Tab.2 Linear regression equations, correlation coefficients(r), and linear ranges of four components |
精密吸取每1 mL含乙酸龙脑酯0.053 8 mg，百秋李醇0.129 8 mg，吉马酮0.110 1 mg，去氢木香内酯0.146 9 mg的混合对照品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果上述4个成分峰面积的RSD分别为1.02%、0.91%、0.83%、0.92%，表明仪器精密度良好。
2.1.6 稳定性试验取同一份供试品溶液（样品批号151015），室温下放置，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样分析。结果不同时间乙酸龙脑酯、百秋李醇、吉马酮、去氢木香内酯峰面积的RSD分别为0.35%、0.59%、1.65%、1.36%，表明供试品溶液中4个成分在24 h内稳定。
2.1.7 重复性试验取同一批样品（批号151015），按“2.1.2”项下的方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.3”项下条件进样测定，测得乙酸龙脑酯、百秋李醇、吉马酮、去氢木香内酯的平均含量（n=6）分别为0.002 5、0.063 7、0.079 4、0.156 6 mg·g-1，RSD分别为1.9%、1.6%、1.8%、1.9%，表明本法重复性良好。
2.1.8 加样回收试验精密称取已知含量的样品（批号151015）约5 g共9份，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入混合对照品溶液（每1 mL含乙酸龙脑酯0.002 7 mg、百秋李醇0.060 3 mg、吉马酮0.078 5 mg、去氢木香内酯0.162 5 mg）2、5和10 mL，按“2.1.2”项下方法制备成供试溶液，按“2.1.3”项色谱条件下进样测定，记录各成分的峰面积，计算加样回收率。结果见表 3。
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表 3 样品中4个成分的加样回收试验结果（n=9） Tab.3 Results of recovery test of four components in sample |
取对照制剂和37批沉香化气丸样品，分别按“2.1.2”项下的方法制备对照制剂溶液与供试品溶液，按“2.1.3”项下的色谱条件进样测定，记录峰面积，按照外标法计算含量。结果37批样品均检出乙酸龙脑酯、百秋李醇、吉马酮、去氢木香内酯，但乙酸龙脑酯、百秋李醇、吉马酮3个成分的含量均远低于对照制剂，说明本品砂仁、广藿香、醋莪术的投料质量有待提高，这也可能与上述成分不稳定，在常温放置过程中挥发或降解有关。具体结果见表 4。
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表 4 37批样品多成分含量测定结果 Tab.4 Determination results of multi components in 37 samples |
精密称取沉香四醇对照品适量，加甲醇制成每1 mL含沉香四醇9.13 μg的溶液，即得。
2.2.2 供试品溶液及对照制剂溶液的制备取供试品或对照制剂适量，研细，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）60 min，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 色谱条件采用Phenomenex Luna C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0~35 min，10%A；35~37 min，10%A→90%A；37~47 min，90%A），检测波长252 nm，流速1 mL·min-1，柱温40 ℃，进样量20 μL。对照品溶液、供试品溶液和对照制剂溶液的液相色谱图见图 2。
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1.沉香四醇（agarotetrol） A.对照品溶液（reference substance solution）B.供试品溶液（test solution）C.对照制剂溶液（reference drug solution） 图 2 沉香四醇液相色谱图 Fig.2 HPLC chromatograms of agarotetrol |
精密量取对照品储备液适量，加甲醇制成每1 mL中含沉香四醇分别为0.182 6、0.456 5、0.913 0、1.826、2.739、4.565、9.130 μg的系列对照品溶液，按“2.2.3”项色谱条件下进样测定，以质量浓度X（μg·mL-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明沉香四醇质量浓度在0.182 6~ 9.130 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系，回归方程：
Y=47 779.3X+883.1 r=0.999 9
2.2.5 精密度试验取2.739 μg·mL-1的沉香四醇对照品溶液，按“2.2.3”项色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果沉香四醇峰面积的RSD为0.32%，表明仪器精密度良好。
2.2.6 稳定性试验取同一份供试品溶液（样品批号150912），室温下放置，分别于0、2、4、8、12、24 h按照“2.2.3”项下的色谱条件进样分析。结果沉香四醇峰面积的RSD为1.0%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
2.2.7 重复性试验取同一批样品（批号150912），按“2.2.2”项下的方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件进样测定。测得沉香四醇的平均含量（n=6）为0.033 7 mg·g-1，RSD为0.67%，表明本法重复性良好。
2.2.8 加样回收试验精密称取沉香四醇对照品（含量96.8%）0.009 27 g，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得沉香四醇对照品母液（即每1 mL含沉香四醇0.179 47 mg）。精密量取沉香四醇对照品母液2 mL，置250 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得沉香四醇回收试验用对照品溶液（每1 mL含沉香四醇1.435 8 μg）。
取已知含量的同一批样品（批号150912）研细，取9份，每份约1 g，精密称定，分别精密加入沉香四醇回收试验用对照品溶液25 mL，按“2.2.2”项下的方法制备回收试验用供试溶液，按拟定的色谱条件进样测定，计算沉香四醇的回收率。结果平均回收率（n=6）为101.7%，RSD为0.87%，说明本方法的准确度较好，见表 5。
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表 5 样品中沉香四醇的加样回收试验结果（n=6） Tab.5 Results of recovery test of agarotetrol in sample |
取对照制剂和37批沉香化气丸样品，按“2.2.2”项下的方法制备对照制剂溶液与供试品溶液，按“2.2.3”项下的色谱条件进样测定，记录峰面积，按外标法计算含量。具体结果见表 4。37批样品中仅15批样品检出沉香四醇，检出率为41.7%，其余样品沉香四醇含量也低于对照制剂，说明本品中沉香的投料质量堪忧。
2.3 UPLC波长切换法同时测定沉香化气丸中6个成分的含量[2] 2.3.1 混合对照品溶液的制备精密称取甘草苷、芸香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸、木香烃内酯和广藿香酮的对照品适量，加甲醇制成每1 mL含甘草苷0.020 8 mg，芸香柚皮苷0.030 3 mg，橙皮苷0.069 0 mg，甘草酸0.020 7 mg，木香烃内酯0.025 9 mg和广藿香酮0.021 1 mg的混合对照品溶液。
2.3.2 供试品溶液的制备取沉香化气丸样品，研细，取约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）45 min，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。
2.3.3 色谱条件采用Phenomenex Kinetex C18色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0~7 min，12%A；7~14 min，12%A→18%A；14~18 min，18%A→35%A；18~35 min，35%A→40%A；35~37 min，40%A→~90%A；37~45 min，90%A），分段变波长测定（0~18 min，210 nm；18~25 min，254 nm；25~31 min，210 nm；31~ 40 min，310 nm；40~55 min，210 nm），流速0.8 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量2 μL。混合对照品溶液、供试品溶液和对照制剂溶液的UPLC色谱图见图 3。
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1.甘草苷（liquiritin）2.芸香柚皮苷（narirutin）3.橙皮苷（hesperidin）4.甘草酸铵（glycyrrhizic acid）5.木香烃内酯（costunolide）6.广藿香酮（pogostone） A.混合对照品溶液（mixed reference solution）B.供试品溶液（test solution）C.对照制剂溶液（reference drug solution） 图 3 超高效液相色谱图 Fig.3 UPLC chromatograms |
取对照制剂和37批沉香化气丸样品，按“2.3.2”项下的方法制备对照制剂溶液与供试品溶液，按“2.3.3”项下的色谱条件进样测定，记录峰面积，按照外标法计算含量。结果37批样品均检出甘草苷、芸香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸、木香烃内酯、广藿香酮，其含量与对照制剂相接近，且有高有低，说明本品甘草、陈皮、木香、广藿香的投料质量较好。具体结果见表 4。
3 讨论由于乙酸龙脑酯和吉马酮不稳定，故暂不选取其作为含量测定指标。按本文的方法分别测定对照制剂和制备对照制剂的原料中百秋李醇、沉香四醇、甘草苷、芸香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸、去氢木香内酯和木香烃内酯的总量、广藿香酮的含量，计算出转移率分别为79.80%、90.60%、69.60%、80.80%、100.0%、55.80%、53.00%、40.90%。按照《中华人民共和国药典》2015年版一部中各药味相关组分的含量限度与转移率计算出沉香化气丸中百秋李醇、沉香四醇、甘草苷、橙皮苷、甘草酸、去氢木香内酯和木香烃内酯的总量的含量限度分别为0.11、0.030、0.21、1.67、0.67、0.53 mg·g-1，作为二级品拟定限度，即使用符合药典规定的药材足量投料应达到的限度，其中广藿香酮与芸香柚皮苷《中华人民共和国药典》未规定限度，以对照制剂该组分含量的50%作为限度，分别为0.10、0.41 mg·g-1。暂定对照制剂中各组分的含量为一级品限度，即使用优质药材足量投料达到的限度。37批样品中百秋李醇、沉香四醇、甘草苷、芸香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸、去氢木香内酯和木香烃内酯的总量、广藿香酮的含量测定结果分别为0.02~0.20、ND~0.096、0.18~0.75、0.49~3.03、4.13~12.26、0.38~ 0.86、0.28~2.75、0.13~0.33 mg·g-1。按上述拟定限度判断，结果各批样品均有组分低于二级品限度，4个厂家的37批样品均为级外品，其中22批样品未能检出沉香四醇，说明沉香化气丸质量状况不容乐观。
由于《中华人民共和国药典》2015年版一部沉香化气丸项下仅对陈皮中橙皮苷进行了定量检测，其余药味只进行显微或薄层色谱定性鉴别，只能对企业是否投料进行判断，无法判断企业投料用原料药材的质量。本研究对37批样品进行检测，发现只有橙皮苷均达到二级限度，其余组分均有部分批次达不到二级限度。说明生产企业投料中存在以次充好，偷工减料，原药材质量不达标等问题。
中成药一般为复方制剂，处方中的药味在制剂过程中化学成分可能会相互影响发生变化，中药对照制剂严格按照制法和生产工艺规程进行研制，其组分的含量与实际样品更加一致[12-13]。测定其组分的含量和转移率来制定沉香化气丸各组分的含量限度，更能客观地衡量样品中原料药材投料的优劣。本次实验将中药对照制剂应用于所建立的多组分含量研究中，为进一步建立药品质量评价新模式提供客观依据。
| [1] |
中华人民共和国药典2015年版.一部[S].2015: 990 ChP 2015.Vol Ⅰ[S].2015: 990 |
| [2] |
潘玄玄, 宋粉云, 李华, 等. UPLC波长切换法同时测定沉香化气丸中7个成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2017, 37(10): 1832. PAN XX, SONG FY, LI H, et al. Simultaneous determination of seven components in Chenxiang Huaqi pills by UPLC with wavelength switching[J]. Chin J Pharm Anal, 2017, 37(10): 1832. |
| [3] |
马丽娜, 郭伟英. 毛细管气相色谱法同时测定沉香化气丸中3个成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2012, 32(9): 1559. MA LN, GUO WY. Simultaneous determination of three components in Chenxiang Huaqi pills by capillary GC[J]. Chin J Pharm Anal, 2012, 32(9): 1559. |
| [4] |
郭琪, 闫艳, 王海波, 等. HPLC波长切换法同时测定清热解毒颗粒中8个成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2015, 35(9): 1601. GUO Q, YAN Y, WANG HB, et al. Determination of eightcomponents in Qingrejiedu granules by HPLC with UV switch[J]. Chin J Pharm Anal, 2015, 35(9): 1601. |
| [5] |
张小龙, 孙晓, 姚晨旭, 等. GC法同时测定肚痛丸中6种有效成分的含量[J]. 中国药师, 2018, 21(3): 518. ZHANG XL, SUN X, YAO CX, et al. Simultaneous determination of six effective components in Dutong pills by GC[J]. China Pharm, 2018, 21(3): 518. DOI:10.3969/j.issn.1008-049X.2018.03.044 |
| [6] |
尤立华, 杨秉呼, 叶萌, 等. 气相色谱法同时测定大活络胶囊多组分含量[J]. 中国药业, 2014, 23(19): 38. YOU LH, YANG BH, YE M, et al. Simultaneous determination of various components in Dahuoluo capsule by GC[J]. China Pharm, 2014, 23(19): 38. |
| [7] |
田志杰. 气相色谱法同时测定复方樟脑乳膏中4种成分含量[J]. 中国药品标准, 2018, 19(2): 141. TIAN ZJ. Simultaneous determination of four constituents in compound camphor cream by GC[J]. Drug Stand China, 2018, 19(2): 141. |
| [8] |
孙云鹏, 汪琛媛, 王国凯, 等. 四味黄连洗剂的UPLC指纹图谱研究及主成分的含量测定[J]. 华西药学杂志, 2017, 32(6): 629. SUN YP, WANG CY, WANG GK, et al. Study on the UPLC fingerprint and determination of index components of Siwei Huanglian lotion[J]. West China J Pharm Sci, 2017, 32(6): 629. |
| [9] |
王丹丹, 闫艳, 张福生, 等. 远志药材UPLC指纹图谱及多指标性成分测定方法的建立[J]. 中草药, 2018, 49(5): 1150. WANG DD, YAN Y, ZHANG FS, et al. Establishment for methods of fingerprint analysis and determination of index compounds on commercial Polygala tenuifolia by ultra performance liquid chromatography[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2018, 49(5): 1150. |
| [10] |
聂黎行, 戴忠, 马双成. 中药对照制剂研制指导原则和技术要求[J]. 中国中药杂志, 2017, 42(9): 1601. NIE LX, DAI Z, MA SC. Guideline principle and technical requirement for preparing traditional Chinese medicine reference drug[J]. Chin J Tradit Chin Med, 2017, 42(9): 1601. |
| [11] |
孙国祥, 张宇, 高嘉悦, 等. 内标定量指纹图谱法筛选冠心苏合丸对照制剂[J]. 中草药, 2014, 45(5): 642. SUN GX, ZHANG Y, GAO JY, et al. Selection of Guanxin Suhe pill reference preparation by internal standard quantified fingerprints method[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2014, 45(5): 642. |
| [12] |
聂黎行, 查祎凡, 胡晓茹, 等. 基于对照制剂的牛黄清胃丸全处方鉴别研究和等级初评价[J]. 中草药, 2018, 49(22): 5320. NIE LX, ZHA YF, HU XR, et al. Whole-ingredient identification and primary grade evaluation of Niuhuang Qingwei pills based on reference drug[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2018, 49(22): 5320. DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2018.22.015 |
| [13] |
杨立伟, 王海南, 耿莲, 等. 基于标准汤剂的中药整体质量控制模式探讨[J]. 中国实验方剂学杂志, 2018, 24(8): 1. YANG LW, WANG HN, GENG L, et al. Discussion on whole quality control mode of traditional Chinese medicine based on standard decoction[J]. Chin J Exp Tradit Med Form, 2018, 24(8): 1. |