2019, Vol. 39 
六味安消散（蒙药名：西吉德-6）是蒙古族和藏族地区的传统验方，主要由藏木香、大黄、北寒水石、山柰、诃子和碱花共6味药材组成，具有和胃健脾、消积导滞、活血止痛之功效[1-2]。据文献报道，藏木香含有内酯类活性成分[3-4]，有健脾和胃、调气解郁止痛、安胎等功效[5]；大黄含有蒽醌类活性成分[6-7]，有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒和逐瘀通经等功效；山柰含有黄酮类化合物，具有行气温中、消食和止痛功效[8-9]；诃子可以涩肠止泻、敛肺止咳及降火利，主要含有鞣质类活性成分[10]。六味安消散已被《中华人民共和国药典》2015年版一部收载，质量标准已对大黄素和大黄酚做了定量质量要求。关于木香烃内酯和去氢木香烃内酯含量的研究已有相关报道，史沁芳等[11]使用HPLC测定木香非药用部位木香烃内酯和去氢木香烃内酯含量，张杰等[12]探讨了丛枝菌根真菌对云木香根产量及木香烃内酯和去氢木香烃内酯含量的影响。
60Co-γ射线具有很好的杀虫和灭菌作用，与传统灭菌方式相比，具有穿透力强、经济和安全等诸多优点，60Co-γ辐照灭菌对药品质量影响很小，经必要的方法学验证，已逐步广泛应用于中药灭菌领域中[13-16]。中药制剂大多由数味药材制成，成分复杂，中药指纹图谱法能较全面地反映出其内含化学成分的种类及数量，进而对药品质量进行系统客观评价[15]。60Co-γ射线辐照灭菌对中药指纹图谱和有效成分含量影响的研究已见多文发表，张立雯等[16]研究了龙胆和秦艽60Co-γ辐照前后指纹图谱变化，黄晓婧等[17]对60Co-γ辐照补骨脂药材指纹图谱的影响开展了研究。为考证60Co-γ射线对六味安消散辐照灭菌的可行性，本研究采用HPLC法，建立六味安消散指纹图谱，考察不同辐照剂量对指纹图谱的影响，并建立木香烃内酯、去氢木香烃内酯、大黄素和大黄酚4个化合物含量测定方法，进一步验证60Co-γ射线辐照灭菌对六味安消散质量的影响程度，为六味安消散采用60Co-γ辐照灭菌提供参考依据。
1 仪器和材料Waters e2695型高效液相色谱仪（沃特世公司）；Mettler XP26型电子天平（梅特勒-托利多公司）；Elma S300型超声波清洗机（Elma公司，频率37 kHz，功率300 W）。
对照品木香烃内酯（批号111524-201710，含量99.5%）、去氢木香烃内酯（批号111525-201711，含量99.8%）、大黄素（批号110756-201512，含量98.7%）、大黄酚（批号110796-201621，含量99.2%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。六味安消散15批（S1-20170401、S2-20170501、S3-20170502、S4-20170611、S5-20170708、S6-20170710、S7-20170901、S8-20170902、S9-20170903、S10-20171010、S11-20172012、S12-20171015、S13-20170801、S14-20170802、S15-20170803），金诃藏药股份有限公司生产；《中药辐照灭菌技术指导原则》（2015年）规定中药60Co-γ射线辐射灭菌剂量应不大于10 kGy，本研究分别以0、2、5、10 kGy剂量辐照处理样品。
2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 混合对照品储备溶液分别取木香烃内酯、去氢木香烃内酯、大黄素和大黄酚的对照品各适量，以甲醇为溶剂，制成质量浓度分别为36.34、44.89、8.12、26.65 μg·mL-1的混合对照品储备溶液。
2.1.2 供试品溶液取本品10 g，研细，过筛（80目），取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇35 mL，称量，超声处理（功率300 W，频率37 kHz）30 min，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2 色谱条件及系统适用性实验色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；以甲醇为流动相A，0.1%磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱（0~5 min，15%A；5~15 min，20%A→60%A；15~28 min，60%A；28~45 min，60%A→85%A；45~65 min，85%A），流速为1.0 mL·min-1；柱温35 ℃；进样量10 μL；检测波长230 nm。取“2.1.1”项混合对照品溶液，按上述色谱条件进样分析，结果各色谱峰分离度均大于1.5，木香烃内酯、去氢木香烃内酯、大黄素和大黄酚的理论板数均大于3 500，各峰对称性在0.92~1.07之间，连续进样6针，各组分色谱峰面积的RSD小于0.6%，系统适用性良好。
2.3 六味安消散HPLC指纹图谱的研究 2.3.1 稳定性试验取未经辐照六味安消散供试品溶液一份，按“2.2”项下色谱条件，分别在0、3、6、9、12、24 h进样，记录色谱图，以0 h样品指纹图谱为对照，计算相似度，结果各指纹图谱相似度结果均不小于0.98，符合指纹图谱相关技术要求（≥0.95），表明供试品溶液24 h内稳定性良好。
2.3.2 重复性试验取同一批未经辐照六味安消散6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项下色谱条件下测定，记录色谱图，以其中任一指纹图谱为对照，计算相似度，结果均不小于0.98（≥0.95），表明本方法重复性良好。
2.3.3 六味安消散指纹图谱的建立取15批经0、2、5、10 kGy剂量辐照处理的六味安消散样品适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件测定，记录色谱图。分别将经0、2、5、10 kGy剂量辐照处理的六味安消散指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件，设置时间窗为0.2 min，采用中位矢量法多点校正，分别生成经0、2、5、10 kGy剂量辐照处理后六味安消散的对照指纹图谱。指纹图谱及共有模式见图 1。
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10.木香烃内酯（costunolide）11.去氢木香内酯（dehydrocostuslactone）17.大黄素（emodin）20.大黄酚（chrysophanol） 图 1 六味安消散HPLC指纹图谱（A~D）和混合对照品（E）色谱图 Fig.1 HPLC chromotograms of Liuwei Anxiao powder(A-D)and mixed reference substances(E) |
经60Co-γ射线2、5、10 kGy剂量辐射处理后的六味安消散指纹图谱中，15批供试品的共有峰个数均未发生变化，共检测到21个共有峰，与“2.1.1”项下混合对照品比对，可确认10号峰为木香烃内酯，11号峰为去氢木香内酯，17号峰为大黄素，20号峰为大黄酚。
取供试品指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件，以未辐照（0 kGy）样品图谱为参照，经多点校正，全谱段峰匹配，生成对照图谱，计算各批不同辐照剂量与对照指纹图谱的相似度。结果见表 1。
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表 1 相似度计算结果 Tab.1 The result of similarities |
精密量取“2.1.1”项下混合对照品溶液0.5、2、3、5、8、10 mL，分别置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成系列浓度混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，记录色谱图。以各组分质量浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，色谱峰峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，并计算相关系数，结果见表 2。
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表 2 4个成分线性回归方程 Tab.2 Calibration curves of 4 components |
精密吸取六味安消散供试品溶液（批号20170801），按“2.2”项下色谱条件，连续进样5次，记录色谱图。木香烃内酯、去氢木香烃内酯、大黄素和大黄酚峰面积的RSD分别为0.22%、0.18%、0.15%和0.30%，表明仪器精密度良好。
2.4.3 稳定性试验取六味安消散供试品溶液（批号20170801），按“2.2”项下色谱条件，分别于0、4、8、12、15、24 h进样测定，记录色谱图。木香烃内酯、去氢木香烃内酯、大黄素和大黄酚峰面积的RSD分别为1.3%、1.0%、1.1%和1.1%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.4.4 重复性试验取六味安消散供试品（批号20170801）6份，按“2.1.2”项方法处理，按“2.2”项下色谱条件测定，记录色谱图。木香烃内酯、去氢木香烃内酯、大黄素和大黄酚的平均含量分别为2.31、2.26、0.45、1.37 mg·g-1，RSD分别为0.35%、1.1%、0.55%和0.86%，表明本方法重复性良好。
2.4.5 加样回收率试验取六味安消散供试品（批号20170801）9份，分为3组，每组3份，每组按木香烃内酯、去氢木香烃内酯、大黄素和大黄酚已知含量的80%、100%、120%精密加入对照品。按“2.1.2”项下方法制备供试溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，计算各组分加样回收率。结果见表 3，木香烃内酯、去氢木香烃内酯、大黄素和大黄酚平均加样回收率（n=9）分别为99.6%（99.5%、99.8%、99.5%）、99.1%（98.7%、98.7%、100.0%）、99.5%（99.2%、99.4%、99.9%）和99.2%（99.0%、99.3%、99.5%）。
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表 3 六味安消散中4个成分的加样回收率结果（n=9） Tab.3 Recoveries of 4 maker components in Liuwei Anxiao powder |
取经0、2、5、10 kGy剂量辐照处理的六味安消散适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定分析，记录色谱图，计算各组分含量，结果见表 4。
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表 4 六味安消散4个成分含量测定结果 Tab.4 Determination of 4 maker components in Liuwei Anxiao powder |
60Co-γ射线辐射灭菌是指将物品置于适宜放射源辐射的γ射线发生的电子束中进行电离辐射而达到杀灭微生物的方法[18]。国家食品药品监督管理总局发布的《中药辐照灭菌技术指导原则》（2015版）建议尽可能采用低剂量辐照灭菌，中药最大总体平均辐照剂量原则上不超过10 kGy，并且需要通过一定的研究工作，考察和评估辐照灭菌对中药安全性、有效性及稳定性的影响。本研究分别采用2、5、10 kGy剂量对六味安消散进行辐照处理，考察其对指纹图谱和指标成分的影响，并确定最佳灭菌处理参数。从表 1可知，六味安消散经不同剂量60Co-γ射线辐射处理后，与未经处理指纹图谱相似度比较，发现0、2、5 kGy处理过的供试品指纹图谱相似度均大于0.95，而辐照剂量为10 kGy时，相似度平均值为0.827 4，小于0.95，表明虽然指纹图谱共有峰数量没有变化，但与未经辐照供试品比较，相似度已经有所下降。从表 3可以看出，当辐照剂量为2、5 kGy时，供试品中4个成分含量没有显著性变化（P > 0.05）；当剂量上升至10 kGy时，木香烃内酯、去氢木香烃内酯、大黄素和大黄酚含量变化具有统计学意义（P < 0.05），其中以去氢木香烃内酯和大黄酚变化最为显著，含量变化结果进一步印证指纹图谱相似度评价结果。所以采用60Co-γ射线对六味安消散进行辐射灭菌时，辐照剂量以5 kGy为宜。
3.2 灭菌效果检查取经不同辐照剂量处理供试品适量，称取10 g，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，混匀，制成1:10、1:100、1:1000的待测液。取制备好的待测液l mL，置无菌平皿（直径90 mm）中，注入20 mL胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基（温度不超过45 ℃），混匀，待凝固，置培养箱中倒置培养，检查需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。结果见表 5。
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表 5 辐照前后药材含菌量测定结果 Tab.5 Results of bacteria level in the crude drug before and after irradiation |
《中华人民共和国药典》2015年版四部规定，口服给药固体制剂中需氧菌总数不得超过103 cfu·g-1，霉菌和酵母菌总数不得超过102 cfu·g-1，从表 4可以看出，60Co-γ射线辐射处理前，供试品微生物限度超过药典标准，当辐照剂量为5 kGy时，需氧菌及霉菌和酵母菌总数含有量大幅降低，证明该方法对六味安消散具有很好的杀菌作用。
为考察60Co-γ射线对六味安消散辐照灭菌可行性，本研究建立了六味安消散指纹图谱和4个成分含量测定方法，通过验证确定，当辐照剂量为5 kGy时，射线能很好杀灭六味安消散中微生物，且对指纹图谱和4个活性成分含量影响不显著，可为该药辐照灭菌提供参考。
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