2019, Vol. 39 
2. 北京石油化工学院, 北京 102617;
3. 西安交通大学法医学院, 西安 710061
2. Beijing Institute of Petrochemical Technology, Beijing 102617, China;
3. School of Forensic Medicine, Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710061, China
度鲁特韦（dolutegravir）是由葛兰素史克（GSK）公司旗下的ViiV Healthcare公司开发的抗人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染药物，是第2代HIV整合酶抑制剂，能阻止病毒DNA链向宿主DNS转移，可与其他抗逆转录病毒药物联合使用[1-2]。体内外试验研究均显示，度鲁特韦有较强的抗HIV-1病毒活性，临床研究显示，其与第1代HIV整合酶抑制剂雷特格韦、埃替格韦相比，有较好的安全性、药效及耐受性，不良反应少，不影响联用药物的疗效及药动学参数[3]，能显著延长艾滋病患者的寿命，是临床应用前景很好的抗艾滋病新药。美国FDA以优先审评肯定了该药的突破性，于2013年8月12日批准其上市。临床使用度鲁特韦钠盐（dolutegravir sodium，商品名为Tivicay，DTGS），结构式见图 1，剂型为10、25及50 mg薄膜包衣片，目前国内尚未批准该药物的进口[4]。
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图 1 DTGS的结构式 Fig.1 The structure of DTGS |
马丁代尔大药典[5]对DTGS的基本信息、用法用量、不良反应以及药代动力学信息做了简单的介绍，国内外其他药典尚未收载该品种。药物的物理化学参数与生物体内膜渗透性具有一定的相关性，平衡溶解度能够结合其他参数推测药物在生物体内的吸收状况，因此测定药物的平衡溶解度具有重要意义[6-8]。目前国内外未见对DTGS平衡溶解度测定的文献报道，本文建立适用于DTGS理化性质研究的反相高效液相色谱法，进行相应的方法学验证，并在此基础上，采用摇瓶法测定DTGS在不同pH缓冲液中的平衡溶解度，为DTGS剂型选择、处方研究及合理用药提供参考，同时为其生物药剂学分类及一致性评价研究提供基础数据。
1 仪器与试药 1.1 仪器Waters e2695-2998高效液相色谱仪（Waters公司），Mettler XP 205DR十万分之一电子天平（Mettler公司），Mettler S40K酸度计（Mettler公司），HERMLE Z300K离心机（HERMLE公司），TS-110X30水浴恒温振荡器（上海天呈实验仪器制造有限公司），Waters Symmetry Shield-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶，Waters公司）。
1.2 试药与材料DTGS原料药（批号LDX170021），Cipla公司；氢氧化钠（含量≥96.0%）、氯化钠（含量≥99.5%）、二水合磷酸二氢钠（含量≥99.0%）、无水乙酸钠（含量≥99.0%）、磷酸（含量≥85.0%）、盐酸（含量36.0%~38.0%）、乙酸（含量36.0%~38.0%），国药集团化学试剂有限公司；甲醇（含量99.9%），Fisher公司；乙腈（含量≥99.9%），Solvslichro公司；水为超纯水；MCM滤膜（0.22 μm和0.45 μm，25 mm）天津博纳艾杰尔科技有限公司。
2 方法与结果 2.1 反相高效液相色谱方法的建立 2.1.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱：Waters Symmetry Shield-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为0.042 5 mol·L-1磷酸盐缓冲液500 mL，用2 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH至6.8，加入甲醇500 mL混匀，流动相B为1%磷酸乙腈溶液，A-B（85:15）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：260 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 µL。在上述色谱条件下测定，色谱图见图 2，DTGS的保留时间为8.5 min，峰形良好，空白溶剂对测定无干扰。
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图 2 DTGS的HPLC色谱图 Fig.2 HPLC chromatogram of DTGS |
以强力破坏试验验证方法的专属性。取DTGS原料药，分别在①加1 mol·L-1盐酸溶液10 mL，70 ℃水浴中放置1 h；②加1 mol·L-1氢氧化钠溶液10 mL，70 ℃水浴中放置1 h；③加3%过氧化氢溶液10 mL，室温放置30 min；④90 ℃水浴中加热3 h；⑤4 000 lx光强度下照射10 d等极端条件进行破坏试验后，按“2.1.1”项下色谱条件进行检测。结果表明，本品经上述极端条件加速降解后，DTGS仅在酸破坏条件下发生降解，在碱、氧化、高温及光照破坏条件下均较稳定；降解产物峰均能与DTGS主成分峰达到基线分离，降解产物之间也有良好的分离度，二极管阵列检测分析结果显示，主成分峰中未发现杂质，表明方法专属性良好。见图 3。
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1.DTGS A1.酸破坏溶液（acid destroyed solution）A2.酸破坏空白溶液（acid destroyed blank solution）B1.碱破坏溶液（alkali destroyed solution）B2.碱破坏空白溶液（alkali destroyed blank solution）C1.氧化破坏溶液（oxidation destroyed solution）C2.氧化破坏空白溶液（oxidation destroyed blank solution）D1.高温破坏溶液（high temperature destroyed solution）D2.高温破坏空白溶液（high temperature destroyed blank solution）E1.光照破坏溶液（light destroyed solution）E2.光照破坏空白溶液（light destroyed blank solution） 图 3 专属性试验HPLC色谱图 Fig.3 The HPLC chromatograms for specificity |
取DTGS原料药适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成0.35 mg·mL-1的溶液，作为储备液，吸取储备液用流动相稀释，制成0.005、0.021、0.070、0.105、0.175、0.350 mg·mL-1的系列标准溶液。分别吸取上述标准溶液10 µL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以DTGS浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线。线性回归方程：A=3.433×107C-1.007×105 r=0.999 9
结果表明，DTGS在0.005~0.350 mg·mL-1范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。
2.1.4 定量下限取“2.1.3”项下储备液，加流动相逐级稀释，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，测得定量下限（S/N=10）为1.0 ng。
2.1.5 精密度试验按“2.1.3”项下方法制备高、中、低浓度（0.140、0.088、0.035 mg·mL-1）的DTGS溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样5次测定，记录峰面积，计算RSD分别为0.53%、0.43%、0.77%，表明该方法的精密度良好。
2.1.6 准确度试验取高、中、低浓度（0.140、0.088、0.035 mg·mL-1）的DTGS溶液，依据线性回归方程得到对应的浓度，利用公式：准确度=（理论浓度值-实测浓度值）/理论浓度值×100%，计算出高、中、低浓度的平均准确度分别为0.74%、-0.23%、0.76%（表 1），表明该方法的准确度良好。
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表 1 准确度测定结果（%） Tab.1 The results of accuracy |
取0.088 mg·mL-1的DTGS溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进行检测并记录峰面积，计算RSD为0.60%，表明溶DTGS液室温放置24 h稳定性良好。
2.2 DTGS平衡溶解度的测定 2.2.1 缓冲液的制备pH1.2氯化钠-盐酸缓冲液：称取氯化钠2.52 g，加水900 mL，用70 g·L-1盐酸溶液调节pH为1.2，并用水稀释定容至1 000 mL，即得。
pH 4.5醋酸盐缓冲液：称取无水乙酸钠2.99 g，加水900 mL，用120 g·L-1醋酸溶液调节pH为4.5，并用水稀释定容至1 000 mL，即得。
pH 6.8磷酸盐缓冲液：称取二水合磷酸二氢钠7.8 g和氢氧化钠0.9 g，加水800 mL，用80 g·L-1氢氧化钠溶液调节pH为6.8，并用水稀释定容至1 000 mL，即得。
2.2.2 不同分离方式考察取过量的DTGS原料药，分别置6个15 mL具塞试管中，每个试管中精密加入pH 4.5醋酸盐缓冲液10 mL，置37 ℃恒温水浴中分别振摇2、4、8、24、48、72 h，每个时间点取出溶液分成3份，1份离心（6 000 r·min-1，37 ℃）10 min，作为样品1，另2份分别经0.22 μm和0.45 μm滤膜过滤，作为样品2和样品3，取上清液或续滤液稀释1倍后，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算每个时间点溶液的浓度，结果见表 2。分析由于DTGS样品粉末较为松散，离心后取上清液时可能混入粉末，造成离心的结果偏高。另溶液中悬浮的粒子可能小于0.45 μm，导致0.45 μm过滤的结果略高于0.22 μm过滤，因此最终选择了0.22 μm过滤的样品分离方式。
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表 2 DTGS样品分离方式的考察 Tab.2 Investigation of the separation method for DTGS |
将恒温水浴的转速分别设置为50、75和100 r·min-1，振摇24 h，分别取出溶液经0.22 μm滤膜过滤，取续滤液稀释1倍后，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，平衡溶解度分别为0.069 6、0.073 7和0.077 1 mg·mL-1，最终确定恒温水浴的转速为75 r·min-1。
2.2.4 平衡时间的确定取“2.2.2”项下经0.22 μm滤膜过滤的溶液，计算振摇不同时间的溶解度，结果DTGS原料药振摇2、4、8、24、48、72 h的溶解度分别为0.059 1、0.061 8、0.070 7、0.073 7、0.065 7、0.072 2 mg·mL-1，从而确定了DTGS在37℃恒温水浴中振摇24 h可达到溶解平衡。
2.2.5 DTGS在不同pH缓冲液中平衡溶解度的测定取过量DTGS原料药，分别置9个50 mL量瓶中，分别加入pH 1.2氯化钠-盐酸缓冲液、pH 4.5醋酸盐缓冲液和pH 6.8磷酸盐缓冲液各25 mL（n=3），在恒温水浴（37 ℃，75 r·min-1）中振摇24 h，取适量溶液经0.22 μm滤膜过滤，续滤液稀释5倍后，按“2.1.1”项下色谱条件进样20 μL测定，记录峰面积，代入线性回归方程计算DTGS在上述缓冲液中的平衡溶解度，测定结果见表 3。
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表 3 DTGS在不同介质中的平衡溶解度 Tab.3 The equilibrium solubility in different medium of DTGS(n=3) |
DTGS在不同pH缓冲液中的溶解度按《中华人民共和国药典》2015年版[9]表示为几乎不溶或不溶，其溶解度不受pH的影响。
3 讨论GSK公司DTGS的专利（专利号：WO2006116764）将于2026年到期，国内企业若想申报该品种仿制药，需要与原研药符合相同的质量、疗效及安全性标准，原则上应采用体内生物等效性试验的方法进行一致性评价，通过本文的研究可以判断DTGS是否符合申请生物等效性试验豁免的条件[10-13]。我国于2016年发布了《人体生物等效性试验豁免指导原则（征求意见稿）》[14]，对于生物药剂学分类系统（BCS）[15]Ⅰ类和Ⅲ类药物，只要处方中的其他辅料成分不显著影响活性药物成分的吸收，则可申请生物等效性试验豁免。
DTGS制剂的最高剂量规格为50 mg，根据测定得到的平衡溶解度计算，DTGS在pH 1.2、pH 4.5和pH 6.8缓冲液中剂量与溶解度的比值分别为701、744、685 mL，根据指导原则的判断标准，最高剂量规格与溶解度的比值等于或小于250 mL可认为是高溶解性的，故判断该品种是低溶解性的药物，不可申请生物等效性试验豁免。
选择250 mL作为剂量与溶解度比值的判断标准是因为在药物动力学生物等效性研究中，制剂是用一大杯水（约250 mL）服用的，如果最高规格的制剂能够在不依赖生理pH的情况下完全溶解在250 mL水中，那么原料药的溶解度就不会成为阻碍该药物在小肠中吸收的因素[12]。
4 结论本文所建立的反相高效液相色谱法，除可测定DTGS的平衡溶解度外，还可用于分析其含量等理化性质。根据指导原则[14]，采用摇瓶法测定了DTGS在不同介质中的平衡溶解度，选择pH 1.2、pH 4.5、pH 6.8缓冲液，模拟人体胃和肠道不同pH下药物的溶解情况，依据测定结果，判断DTGS属于低溶解性药物，不符合申请生物等效性试验豁免的条件，同时为该品种的剂型设计及质控方法研究提供了数据支持。
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