紫花杜鹃为杜鹃花科植物紫花杜鹃（Rhododendron mariae Hance）的干燥叶或带叶嫩枝^[1]，味微辛、性微温，广泛分布于广东省岭南、罗定、高要，云南丽江以及四川宝兴等地区。紫花杜鹃包含挥发油、黄酮、有机酸、萜类、酚类、鞣质等活性成分^[2]，其中黄酮类成分药用效果显著^[3]。研究表明，紫花杜鹃的黄酮类物质具有祛痰止咳、杀菌消炎、镇痛的效果^[4-5]，故在单方和中药复方制剂中都有广泛的应用。目前以紫花杜鹃入药的中成药很多，如紫花杜鹃片、紫花杜鹃胶囊、祛痰止咳颗粒、祛痰止咳胶囊等，临床上对慢性支气管炎有显著的治疗效果^[6]。紫花杜鹃药材的质量控制方法研究较少，《中华人民共和国药典》1977年版及卫生部颁布的中药材标准均无紫花杜鹃药材的鉴别方法和具体含量测定方法，文献报道只是对紫花杜鹃中槲皮素的含量进行了测定^[7-8]，导致市售紫花杜鹃的质量参差不齐，从而影响药材的有效利用及中成药的质量。本研究针对以上情况，采集5个产地15批不同采收期的紫花杜鹃药材进行比较研究，采用HPLC法对黄酮类成分中含有广泛生理活性的槲皮苷、金丝桃苷、槲皮素、芸香苷进行含量测定^[9-13]，为严格把控紫花杜鹃药材的质量，使其资源更合理地应用，以及对该药材更深入的开发研究提供有效依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Agilent1220高效液相色谱仪（安捷伦公司）；BS 124S十万分之一电子天平（Sartourius公司）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品槲皮素（批号100081-200406）、槲皮苷（批号111538-200302）、金丝桃苷（批号111521-200305）、芸香苷（批号100080-200306）均购自中国食品药品检定研究院；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。实验所用紫花杜鹃药材（编号1~15）于2017年4月至6月采自不同产地，由吉林省中医药科学院赵全成教授鉴定均为正品。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱为ACE C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相A相为0.2%磷酸水，B相为乙腈溶液，梯度洗脱（0~15 min，90%A；15~25 min，90%A→85%A；25~35 min，85%A→80%A；35~50 min，80%A→70%A；50~60 min，70%A→65%A；60~70 min，65%A→60%A）；流速为1.0 mL·min^-1；检测波长为254 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。色谱图见图 1。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品芸香苷10.10 mg、金丝桃苷10.80 mg、槲皮苷10.05 mg和槲皮素5.15 mg，分别置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得单一对照品储备液；分别精密量取芸香苷对照品储备液0.5 mL，金丝桃苷对照品储备液1.0 mL，槲皮苷对照品储备液3.0 mL，槲皮素对照品储备液0.4 mL，置同一10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制得每1 mL含芸香苷0.010 1 mg、金丝桃苷0.021 6 mg、槲皮苷0.060 3 mg和槲皮素0.004 1 mg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取样品（过40目筛）0.5 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加入甲醇约40 mL，超声（功率250W，频率40 kHz）提取30 min，放至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密量取混合对照品溶液2、4、8、12、16、20 µL进样测定，以峰面积Y为纵坐标，进样量X（μg）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素的回归方程分别为

Y=2.638×10³X-1.73 r=0.999 6

Y=3.209×10³X-3.54 r=0.999 9

Y=2.100×10³X+11.43 r=0.999 5

Y=4.079×10³X-3.77 r=0.999 0

线性范围分别为0.020 2~0.202 μg、0.043 2~ 0.432 μg、0.120 6~1.206 μg、0.008 2~0.082 μg，各成分进样量与峰面积呈线性关系。

2.5 精密度试验

取供试品溶液（2号样）10 µL，连续进样6次，记录峰面积并计算，芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素峰面积的RSD分别为0.95%、0.54%、0.72%、1.0%，表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性试验

精密量取供试样品（2号样）6份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按色谱条件规定进样测定其峰面积，计算芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷及槲皮素的含量分别为0.147%、0.265%、0.894%、0.020%，RSD分别为0.93%、0.57%、0.69%、1.0%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取供试品（2号样），按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于2、4、8、16、24、48 h进行测定，记录峰面积，计算芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷及槲皮素的含量，结果芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素含量的RSD分别为0.91%、0.56%、0.69%、1.0%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

精密称量已知含量的供试品（2号样）6份，各0.25 g，分别加入适量的对照品，按“2.3”项下方法制备供试溶液并进样测定，计算回收率和RSD，结果见表 1。回收率良好。

2.9 样品含量测定

取不同产地和不同采收期的紫花杜鹃样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样分析，测定芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷及槲皮素的峰面积并计算含量，结果见表 2。

3 讨论 3.1 分析方法确定

由于紫花杜鹃中成分具有多样性，单一浓度甲醇-水、乙腈-水不能将有效成分峰理想分离，所以经过多次试验择优，本实验以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相，采用梯度洗脱，样品中芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素达到基线分离；采用254 nm为检测波长，使样品中的目标峰和杂质峰完全分离；由于芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素为黄酮类的低极性化合物，故选用不同浓度乙醇和甲醇对提取溶剂进行考察，结果表明甲醇提取效果更好；同时采用超声和回流2种提取方法对提取方法进行了考察，实验结果表明，两者提取效率接近，无明显差别，考虑到超声提取操作简单，故此选择超声提取；提取时间考察结果表明，在30 min内目标化合物已充分溶解。

3.2 结果分析

本实验对不同产地和不同采收期的紫花杜鹃干燥叶及嫩枝中的芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素进行含量测定，通过实验看出，不同产地的芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素含量明显不同，同一采收期药材广东罗定的含量最高，云南丽江的含量最低，5月份槲皮苷变化最为明显。不同采收期实验结果表明，广东3个地区的5月份采收的紫花杜鹃中4个成分的含量最高，云南丽江及四川宝兴6月份采收的紫花杜鹃中4个成分的含量最高，推测可能由于地区间的差异，使开花期延后所致，说明紫花杜鹃在花开始开放还未完全开放时有效成分的含量最高，可以为紫花杜鹃的采收期的确定奠定基础。

本研究采用建立的含量测定方法对含紫花杜鹃药材的中成药进行4个黄酮成分的含量测定研究，实验结果表明，本方法适合于含紫花杜鹃药材的中成药的含量测定，其分离度、耐用性等均符合规定。本实验结果可以为紫花杜鹃药材的质量控制研究奠定基础。