2019, Vol. 39 
骨松宝颗粒收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十七册，由淫羊藿、知母、赤芍、续断、川芎、三棱等9味药组成，主要用于骨痿引起的骨折、骨痛、骨关节炎的治疗，以及更年期骨质疏松的预防[1]。现行质量标准中包含了1个煅牡蛎的化学鉴别、1个黄酮类的化学鉴别和1个淫羊藿苷的薄层色谱鉴别，在已有含量测定研究报道中，主要集中于对淫羊藿进行控制[2-6]。淫羊藿是方中主药，具有补益肾阳、强筋健骨、祛风除湿等功效，淫羊藿苷是其最重要的有效成分之一，在促进成骨细胞生成、成熟和矿化的同时，可抑制破骨细胞的生成，具有显著的抗骨质疏松作用[7-10]；芒果苷是知母的主要有效成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用[11-13]；芍药苷在赤芍中含量较高，是赤芍发挥消炎止痛作用的物质基础[14-16]；阿魏酸是川芎和三棱的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗血小板凝聚等作用[17-19]；川续断皂苷Ⅵ是续断中的1种三萜皂苷类化合物，可多靶点发挥抗骨质疏松作用[20]。在《中华人民共和国药典》2015年版中，除三棱未作含量控制外，上述5个成分已作为相应药材的含量测定指标成分[21]。本研究建立HPLC方法同时测定骨松宝颗粒中芒果苷、芍药苷、阿魏酸、淫羊藿苷和川续断皂苷Ⅵ的含量，为更加全面地控制该制剂质量提供参考。
1 仪器与试药 1.1 仪器安捷伦1260型高效液相色谱仪（安捷伦公司）；AG135型十万分之一电子天平、AL204型万分之一电子天平（梅特勒-托利多公司）；HH-6型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；SK250LHC型超声仪（上海科导公司）。
1.2 试药对照品芒果苷（批号111607-201503，纯度98.4%）、芍药苷（批号110736-201741，含量95.7%）、阿魏酸（批号110773-2011012，含量99.6%）、淫羊藿苷（批号110737-201516，含量94.2%）、川续断皂苷Ⅵ（批号111685-201707，含量90.9%），均购于中国食品药品检定研究院；骨松宝颗粒[批号20180204（无糖型）、20180303（无糖型）、20180501（含糖型）]，贵州富华药业有限责任公司生产；淫羊藿、续断、赤芍、川芎、知母、莪术、三棱、地黄和牡蛎（煅）饮片购于都匀市湘君大药房，经黔南州检验检测院夏稷子主任药师鉴定为正品；乙腈为色谱纯；磷酸为优级纯；水为超纯水；其余试剂为分析纯。
2 方法与结果 2.1 色谱条件岛津InertSustain ® C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0~30 min，15%A→20%A；30~50 min，20%A→50%A；50~51 min，50%A→15%A；51~60 min，15%A）；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL·min-1；进样量10 μL；检测波长，川续断皂苷Ⅵ为210 nm，芍药苷为230 nm，芒果苷、阿魏酸和淫羊藿苷为316 nm。
2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液分别取芒果苷、芍药苷、阿魏酸、淫羊藿苷和川续断皂苷Ⅵ的对照品适量，精密称定，加入70%甲醇水制成每1 mL各含128.1、1 211、39.76、812.9和2 641 μg的溶液，即得。
2.2.2 供试品溶液取骨松宝颗粒样品，研细，取约2 g，精密称定，精密加入70%甲醇水25 mL，称量后超声（300 W，33 kHz）30 min，放冷，加入70%甲醇水补足减失的量，用微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
2.2.3 阴性对照溶液照骨松宝颗粒质量标准[1]的处方和制法分别制备缺知母、缺赤芍、缺川芎及三棱、缺淫羊藿、缺续断的5个阴性对照样品，并各取适量，按“2.2.2”项下方法分别制备相应的阴性对照溶液。
2.3 系统适应性试验分别取“2.2”项下的各种溶液，按“2.1”项下条件进样测定。各检测成分与相邻成分之间分离度均大于1.5，阴性无干扰，理论塔板数均大于8 000。HPLC色谱图见图 1。
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1.芒果苷（mangiferin）2.芍药苷（paeoniflorin）3.阿魏酸（ferulic acid）4.淫羊藿苷（icariin）5.川续断皂苷Ⅵ（asperosaponin Ⅵ）A.混合对照品（210 nm检测）[mixed reference substances（detected at 210 nm）] B.混合对照品（230 nm检测）[mixed reference substances（detected at 230 nm）] C.混合对照品（316 nm检测）[mixed reference substances（detected at 316 nm）] D.骨松宝颗粒样品（210 nm检测）[sample of Gusongbao granules（detected at 210 nm）] E.骨松宝颗粒样品（230 nm检测）[sample of Gusongbao granules（detected at 230 nm）] F.骨松宝颗粒样品（316 nm检测）[sample of Gusongbao granules（detected at 316 nm）] G.缺知母阴性样品（316 nm检测）[negative sample without Anemarrhenae Rhizoma（detected at 316 nm）] H.缺赤芍阴性样品（230 nm检测）[negative sample without Paeoniae Radix Rubra（detected at 230 nm）] Ⅰ.缺川芎和三棱阴性样品（316 nm检测）[negative sample without Chuanxion Rhizoma and Sparganii Rhizoma（detected at 316 nm）] J.缺淫羊藿阴性样品（316 nm检测）[negative sample without Epimedii Folium（detected at 316 nm）] K.缺续断阴性样品（210 nm检测）[negative sample without Dipsaci Radix（detected at 210 nm）] 图 1 HPLC色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms |
分别精密吸取“2.2.1”项下各对照品溶液1 mL，置于5、25、100、250 mL量瓶中，加70%甲醇水稀释至刻度，摇匀，即得线性浓度溶液。取“2.2.1”项下对照品溶液及上述4个线性浓度溶液进样测定。以各对照品质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得到回归方程。以信噪比（S/N）约为3:1和信噪比约为10:1时注入仪器的对照品量分别计算检测下限（LOD）和定量下限（LOQ），结果见表 1。
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表 1 各成分的检测下限、定量下限和线性关系 Tab.1 LOD, LOQ and linear relation of five components |
按“2.1”项下条件，取“2.4”项下定容至25 mL的混合对照品溶液连续进样6次，记录各对照品峰面积。结果芒果苷、芍药苷、阿魏酸、淫羊藿苷、川续断皂苷Ⅵ峰面积的RSD分别为0.76%、0.51%、0.96%、0.29%、0.21%。表明仪器的精密度良好。
2.6 稳定性试验取批号为20180501的骨松宝颗粒样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件分别于制备后0、2、4、6、8和12 h测定含量。结果芒果苷、芍药苷、阿魏酸、淫羊藿苷、川续断皂苷Ⅵ含量的RSD分别为1.2%、0.35%、2.7%、0.30%、3.0%。表明供试品溶液在制备后12 h内稳定性良好。
2.7 重复性试验取批号为20180501的骨松宝颗粒样品，按“2.2.2”项下方法制得6份供试品溶液，按“2.1”项下条件测定。结果6份供试品溶液中芒果苷、芍药苷、阿魏酸、淫羊藿苷、川续断皂苷Ⅵ含量的平均值分别为0.058 3、0.570 4、0.019 2、0.455 1、1.327 8 mg·g-1，RSD分别为0.42%、0.20%、0.99%、0.20%、1.0%。表明该方法的重复性良好。
2.8 加样回收率试验分别取芒果苷、芍药苷、阿魏酸、淫羊藿苷和川续断皂苷Ⅵ对照品适量，精密称定，加入70%甲醇水制成每1 mL分别含4.271、37.96、1.327、26.41、87.26 μg的混合对照品储备液。分别精密称取含量已知的骨松宝颗粒（批号20180501）样品6份，每份1 g，精密加入混合对照品储备液15 mL，再精密加入70%甲醇水10 mL，称量后超声（300 W，33 kHz）30 min，放冷，加入70%甲醇水补足减失的量，用微孔滤膜滤过，即得加样回收用供试溶液，按“2.1”项下条件进行测定，计算各成分的加样回收率。结果见表 2。
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表 2 各成分加样回收率测试结果（n=6） Tab.2 Results of recovery tests for five components |
分别取不同批次的骨松宝颗粒样品，每个批次按“2.2.2”项下方法平行制备3份供试品溶液，按“2.1”项下条件外标法测定，各成分含量测定结果见表 3。
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表 3 不同批次样品中5个成分的含量测定结果（mg·g-1，n=3） Tab.3 Determination results of five components in different samples |
实验利用DAD检测器在线采集了5个成分在200~400 nm范围内的吸收光谱，结果显示：川续断皂苷Ⅵ在此范围内无最大吸收，通过预试验选择了210 nm作为其检测波长，在此波长下，川续断皂苷Ⅵ吸收较大，且与相邻峰达到基线分离；芍药苷在230 nm处有最大吸收，且与相邻峰分离较好；芒果苷在258 nm和316 nm处有最大吸收，但在258 nm波长下与相邻峰分离度差；当选择316 nm作为检测波长时，芒果苷、阿魏酸和淫羊藿苷均有较大的吸收，且与相邻成分均达到基线分离。
3.2 提取条件的选择实验考察了不同提取方式（回流提取和超声提取）、提取时间（15、30、45和60 min）和提取溶剂（50%、60%、70%、80%、90%甲醇水和100%甲醇）对样品中各成分提取的影响，结果显示用70%甲醇水超声提取30 min效率较高。
3.3 方法耐用性实验考察了不同柱温（20、25、30、35和40 ℃）对样品中各成分检测的影响。当柱温在30和35 ℃时，各成分与相邻峰均达到了基线分离；而柱温在20、25和40 ℃时，芒果苷、芍药苷和川续断皂苷Ⅵ中的一种或几种与相邻峰分离度较差，因此，建议柱温选在30~35 ℃。
3.4 小结从骨松宝颗粒制备工艺来看，无糖型样品中芒果苷、芍药苷、阿魏酸、淫羊藿苷和川续断皂苷Ⅵ含量（mg·g-1）应约为含糖型样品的2倍，但含量测定结果显示并不完全呈现这样的倍数关系。同为无糖型的2个批次间部分成分的含量也存在较大差异，且制剂指标性成分含量还与生产投料的药材中各成分含量密切相关，因此，有必要建立多指标的质量标准，对生产多环节进行控制，以保证最终制剂质量的稳定性。
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