2019, Vol. 39 
表1(Table 1)
2. 贵州医科大学附属医院, 贵阳 550004;
3. 贵州医科大学基础医学院, 贵阳 550025;
4. 中国科学院地球化学研究所, 贵阳 550081
2. The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China;
3. School of Basic Medicine, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China;
4. Institute of Geochemistry, Chinese Academy of Sciences, Guiyang 550081, China
蜘蛛香又名心叶缬草、老虎七、马蹄香等，系败酱科缬草属植物蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）的干燥根茎及根，主要含有挥发油、环烯醚萜、黄酮、酚酸、生物碱、氨基酸、木脂素和多糖等化学成分，具有镇静、催眠、抗焦虑、抗抑郁、镇痛、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗前列腺增生、保肝和降血压等药理作用[1-5]。《中华人民共和国药典》2010年版蜘蛛香的质量控制指标为乙酰缬草三酯和缬草三酯，但其稳定性差、不易制备、价格昂贵，因而应用受限，《中华人民共和国药典》2015年版取消了蜘蛛香的含量测定项，不能有效地控制其质量，亟需提高其质量标准[6-8]。一测多评法（quantitative analysis of multi-components with a single-marker，QAMS）不仅能实现多成分的同步测定，而且能克服对照品紧缺和检测成本高的困难，是一种适合中药特点的多指标质量评价与控制的新模式[9-12]，尚未见采用QAMS测定蜘蛛香中多种成分含量的文献报道。本文基于前期蜘蛛香HPLC指纹图谱研究[13]，应用QAMS同时测定蜘蛛香中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、橙皮苷、异绿原酸A、异绿原酸C、乙酰缬草三酯、缬草三酯9个成分的含量，为蜘蛛香质量标准提升和修订提供科学参考。
1 仪器与试药Aglient 1260高效液相色谱仪；Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪；赛多利斯BSA224S电子天平；KQ3200E超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。
对照品新绿原酸（批号MUST-15011412，纯度99.37%）、绿原酸（批号MUST-15041814，纯度99.39%）、咖啡酸（批号MUST-15090803，纯度99.99%）、异绿原酸A（批号MUST-15042518，纯度98.82%）、异绿原酸C（批号MUST-15081414，纯度99.84%）均购自成都曼思特生物科技有限公司，异绿原酸B（批号1222BO22，纯度98.00%）和橙皮苷（批号602F022，纯度98.00%）购自北京索莱宝科技有限公司，乙酰缬草三酯（批号wkq16072004，纯度98.00%）和缬草三酯（批号wkq16011203，纯度98.21%）购自四川维克奇生物科技有限公司。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。蜘蛛香药材经贵州医科大学药学院覃容贵教授鉴定为败酱科植物蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）的干燥根茎和根。
2 方法与结果 2.1 溶液制备 2.1.1 对照品溶液精密称取各对照品适量，加甲醇配制成每1 mL分别含新绿原酸5.00 μg、绿原酸40.00 μg、咖啡酸2.20 μg、异绿原酸B 32.90 μg、橙皮苷68.33 μg、异绿原酸A 30.33 μg、异绿原酸C 15.33 μg、乙酰缬草三酯29.17 μg、缬草三酯56.67 μg的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液取蜘蛛香药材粉末（过60目筛）0.2 g，精密称定，准确加入70%甲醇20 mL，称量，超声（功率200 W，频率35 kHz）处理40 min，冷却至室温，用70%甲醇补足减失的量，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.2 色谱条件色谱柱：Diamonsil® C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~18 min，12%A→30%A；18~20 min，30%A→32%A；20~23 min，32%A→40%A；23~25 min，40%A；25~33 min，40%A→53%A；33~90 min，53%A→85%A）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：327 nm（0~33 min）和256 nm（33~90 min）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。在此色谱条件下各成分色谱峰分离度良好，见图 1。
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1.新绿原酸（nechlorogenic acid）2.绿原酸（chlorogenic acid）3.咖啡酸（caffeic acid）4.异绿原酸B（isochlorogenic acid B）5.橙皮苷（hesperidin）6.异绿原酸A（isochlorogenic acid A）7.异绿原酸C（isochlorogenic acid C）8.乙酰缬草三酯（acevaltrate）9.缬草三酯（valepotriate） 图 1 混合对照品（A）和蜘蛛香样品（B）HPLC图 Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A) and Valeriana jatamansi sample(B) |
分别精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液0.5、5、10、15、20、30 μL，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以各成分进样量为横坐标X，峰面积为纵坐标Y进行线性回归，结果各成分在线性范围内线性关系良好，见表 1。
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表 1 9个指标成分的回归方程、相关系数和线性范围 Tab.1 The regression equations, coefficient correlations and linear ranges of nine index components |
取“2.1.1”项下混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积，结果新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、橙皮苷、异绿原酸A、异绿原酸C、乙酰缬草三酯、缬草三酯峰面积的RSD分别为2.4%、1.6%、1.9%、2.1%、1.9%、1.9%、2.2%、1.8%、2.6%，表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验取同1份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件分别在0、3、6、9、12、24 h进样测定，记录峰面积，结果新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、橙皮苷、异绿原酸A、异绿原酸C、乙酰缬草三酯、缬草三酯峰面积的RSD分别为2.7%、2.5%、1.5%、2.4%、0.98%、2.7%、2.4%、2.7%、2.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.3.4 重复性试验取同一批蜘蛛香药材粉末6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，结果新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、橙皮苷、异绿原酸A、异绿原酸C、乙酰缬草三酯、缬草三酯的平均含量分别为0.142、4.057、0.029、0.377、8.671、2.067、2.047、0.408、3.161 mg·g-1，RSD分别为2.1%、2.1%、2.2%、1.7%、1.4%、2.6%、2.4%、2.2%、1.8%，表明方法重复性良好。
2.3.5 加样回收率试验精密称取已测定含量的蜘蛛香药材粉末0.1 g，共6份，精密加入混合对照品溶液（含新绿原酸2.24 μg·mL-1、绿原酸66.60 μg·mL-1、咖啡酸2.16 μg·mL-1、异绿原酸B 9.00 μg·mL-1、橙皮苷171.60 μg·mL-1、异绿原酸A 52.48 μg·mL-1、异绿原酸C 34.32 μg·mL-1、乙酰缬草三酯13.80 μg·mL-1及缬草三酯141.04 μg·mL-1）5 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算各成分加样回收率，结果上述9个成分的平均回收率（n=6）分别为100.9%、100.4%、101.7%、98.5%、99.5%、100.8%、97.6%、97.7%、102.6%，RSD分别为1.2%、1.0%、2.4%、2.1%、1.4%、1.7%、1.0%、1.7%、1.2%，表明方法准确度良好。
2.4 相对校正因子（relative correction factor，RCF）的确定 2.4.1 待测成分RCF的测定精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液0.5、5、10、15、20、30 μL，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以绿原酸（s）为内参物，分别计算待测成分新绿原酸（a）、咖啡酸（b）、异绿原酸B（c）、橙皮苷（d）、异绿原酸A（e）、异绿原酸C（f）、乙酰缬草三酯（g）、缬草三酯（h）的RCF，公式为
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表 2 8个成分的RCF Tab.2 RCFs of eight components |
取“2.1.1”项下混合对照品溶液，分别考察Agilent 1260、Thermo U3000高效液相色谱仪和Diamonsil® C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Inertsil ODS-3色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Wondasil色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）对RCF的影响，结果表明不同高效液相色谱仪及色谱柱对RCF无显著影响，见表 3。
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表 3 不同仪器和色谱柱测得的RCF Tab.3 RCFs determined by different instruments and columns |
取“2.1.1”项下混合对照品溶液，采用Agilent 1260高效液相色谱仪和Diamonsil® C18色谱柱，考察不同流速对RCF的影响，结果表明不同流速对RCF无显著影响，见表 4。
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表 4 不同流速测得的RCF Tab.4 RCFs determined under different flow rate |
取“2.1.1”项下混合对照品溶液，采用Agilent 1260高效液相色谱仪和Diamonsil® C18色谱柱，考察不同柱温对RCF的影响，结果表明不同柱温对RCF无显著影响，见表 5。
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表 5 不同柱温测得的RCF Tab.5 RCFs determined at different column temperature |
以绿原酸（s）色谱峰为参照，分别计算待测成分新绿原酸（a）、咖啡酸（b）、异绿原酸B（c）、橙皮苷（d）、异绿原酸A（e）、异绿原酸C（f）、乙酰缬草三酯（g）、缬草三酯（h）的相对保留时间（RRT），公式为
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表 6 不同仪器和色谱柱下各成分的RRT Tab.6 RRTs determined by different instruments and columns |
取16批蜘蛛香药材，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，采用ESM和QAMS分别计算9个成分含量，运用t检验分析2种方法差异性，结果表明两者间无显著性差异，具有良好的一致性，见表 7。
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表 7 ESM和QAMS测定蜘蛛香中9个成分的含量（mg·g-1，n=2） Tab.7 Contents of 9 components in Valeriana jatamansi determined by ESM and QAMS |
新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、乙酰缬草三酯、缬草三酯的对照品价格昂贵，而绿原酸对照品来源充足，价廉易得，化学性质较稳定，在蜘蛛香药材中含量较高，故选择其为内参物进行QAMS分析。本研究考察了不同仪器、色谱柱、流速、柱温对所建立RCF的影响，结果表明各成分RCF重现性良好。应用保留时间差和RRT分别定位各成分色谱峰，发现RRT在不同仪器和色谱柱中的重复性较好。测定了16批蜘蛛香中的9个成分，结果QAMS与ESM测得含量基本一致，说明QAMS用于蜘蛛香药材质量控制及评价准确可行。
中药成分的复杂性和多效性决定了单一指标成分测定难以实现对其质量的整体控制，故多成分测定是中药质量控制研究的重点；现行蜘蛛香质量标准较简单，不能准确反映不同来源蜘蛛香的质量差异。为实现蜘蛛香药材多种有效成分质量控制，本文应用QAMS测定蜘蛛香中9个成分的含量，可解决乙酰缬草三酯、缬草三酯等对照品缺乏问题，降低多成分含量测定成本，有利于全面反映蜘蛛香的内在质量，对蜘蛛香的质量标准提升及新药开发研究具有重要的科学参考和应用价值。
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