2019, Vol. 39 
洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）为条件致病菌，临床上会导致囊肿性纤维化或免疫力低下的患者严重感染，甚至威胁生命[1-2]。目前该菌已经被FDA明确为不可接受微生物，近年来，在美国屡有因为包括药品和卫生用品在内的健康产品污染该菌而召回的案例，美国食品药物管理局（FDA）也因为该菌的疑似污染若干次发布警告信息[2-3]。
本文在某凝胶剂中检出1株洋葱伯克霍尔德菌，并对该菌进行了核糖体分型、生理生化鉴定和保守序列分析；全面考察了该菌在《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2015年版微生物限度检查法中的各培养体系中的生长情况，对苯扎溴铵等抑菌剂的耐受性以及最低生长水分活度。
1 仪器与材料 1.1 仪器二级生物安全柜（热电公司），KD-240恒温培养箱（BINDER公司），显微镜（奥林巴斯公司），Biolog微生物自动分析系统（BIOLOG公司），Riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定系统（杜邦公司），PCR仪（BIORAD公司），AQUA水分活度测定仪（METER公司）。
1.2 试剂Riboprinter细菌鉴定套装（杜邦公司），BiologGENⅢ细菌鉴定板（BIOLOG公司），API 20NE试剂条（梅里埃公司），细菌基因组DNA提取试剂盒（天根公司），苯酚（SIGMA-ALDRICH公司），间甲酚（SIGMA-ALDRICH公司），羟苯甲酯（国药集团）、羟苯乙酯（国药集团），苯扎氯铵（SIGMA-ALDRICH公司），苯扎溴铵（SIGMA-ALDRICH公司），盐酸氯己定（SIGMA-ALDRICH公司），醋酸氯己定[梯希爱（上海）化成公司]。
1.3 样品凝胶（规格10 mL:30 mg，编号0001、0002、0006、0008），局部和腔道（如尿道或阴道）使用。
1.4 培养基培养基均符合《中国药典》2015年版四部通则[4]1105/1106中的规定。包括胰酪大豆胨液体培养基（TSB，BD公司，500 g·瓶-1）、沙氏葡萄糖液体培养基（SDB，BD公司，500 g·瓶-1）、营养肉汤培养基（NB，北京三药公司，250 g·瓶-1）（符合《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ[5]）、麦康凯液体培养基（MacB，BD公司，500 g·瓶-1）、RV沙门菌增菌液体培养基（RVS，BD公司，500 g·瓶-1）、肠道增菌液体培养基（EE，BD公司，500 g·瓶-1）、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA，BD公司，500 g·瓶-1）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA，BD公司，500 g·瓶-1）、R2A琼脂培养基（R2A，BD公司，500 g·瓶-1）、营养琼脂培养基（NA，北京三药公司，250 g·瓶-1）（符合《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ[5]）、麦康凯琼脂培养基（MacA，BD公司，500 g·瓶-1）、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（VRBG，BD公司，500 g·瓶-1）、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（XLD，BD公司，500 g·瓶-1）、溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基（CA，BD公司，500 g·瓶-1）。
2 方法 2.1 分离微生物的鉴定分析将分离的微生物进行革兰氏染色、镜检。根据Riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定（简称Riboprinter）的核糖体分型进行鉴定和分型。挑选典型的菌株进一步采用API 20NE试剂条、Biolog微生物自动分析系统进行鉴定。并进行16SrDNA和recA基因序列测定[6]，在NCBI数据库中进行比对分析。16S rDNA序列引物为27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492r：TACGGCTACCTTGTTACGACTT；recA序列引物为BCR1：TGACCGCCGAGAAGAGCAA，BCR2：CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC。
2.2 《中国药典》2015年版微生物限度检查法培养体系的生长情况将鉴定为洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）的菌株采用TSA培养基纯培养2代之后，用0.9%无菌氯化钠溶液制备浓度为每0.1 mL含101、102、103、104、105、106 cfu的菌悬液。取上述浓度为101、102、103的菌悬液0.1 mL分别接种至相应液体培养基中，每种浓度每种培养基制备2管，1管置33 ℃培养，另1管置25 ℃培养，逐日观察结果，有必要的情况下，划线至相应琼脂培养基中培养，以确认是否有菌生长。取上述浓度为105、106的菌悬液，划线至相应琼脂培养基平板中，每种浓度每种培养基划线2个平板，1个置33 ℃培养，另1个置25 ℃培养，逐日观察结果。
2.3 抑菌剂最小抑菌浓度（MIC）的测定参照CLSI M07-A10[7]，测定苯酚、间甲酚、羟苯甲酯、羟苯乙酯、苯扎氯铵、苯扎溴铵、盐酸氯己定、醋酸氯己定对分离洋葱伯克霍尔德菌的最小抑菌浓度（µg·mL-1）。
2.4 最低生长水分活度测定采用氯化钠、甘油和蔗糖作为水分活度调节剂，以TSB为基础培养基，分别配制水分活度0.930~0.990之间的TSB培养基，水分活度梯度为0.004~0.006，选取适宜的浓度置无菌96孔板中，并接种洋葱伯克霍尔德菌10~100 cfu菌液，于20、25、30和35 ℃培养14 d，观察生长情况，从而确定最低生长水分活度值。同时测定凝胶剂的水分活度值。
3 结果与讨论 3.1 样品中微生物的分离和鉴别分析情况选择样品中分离出的16株菌进行分析，16株菌均为革兰氏阴性杆菌，其中0001-1号菌株的革兰氏染色照片见图 1。样品中分离出2株：0001-1和0001-2；0002号样品中分离出1株：0002-2；0006号样品中分离出3株：0006-1、0006-2和0006-3；0008号样品中分离出10株：0008-2、0008-3、0008-4、0008-5、0008-6、0008-8、0008-9、0008-10、0008-11和0008-14。
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图 1 0001-1号菌株的革兰氏染色显微镜照片 Fig.1 Microscopic photograph of Gran staining of No. 0001-1 |
如图 2所示，通过核糖体分型，Riboprinter将分离所得革兰氏阴性杆菌鉴定为洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia），并将其分为2组：A组和B组。但是鉴定率并不高，A组为0.80~0.85，B组为0.65~0.70。
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图 2 Riboprinter鉴定及菌株分型结果（{}.与系统数据库相比, 鉴定相似度不高于0.85） Fig.2 Results of identification and strain typing by Riboprinter({}.compared with the system database, the identification similarity is not higher than 0.85) |
从Riboprinter结果中的A组、B组菌选取2株代表菌0001-1和0008-5，分别采用API 20NE试剂条和Biolog微生物自动分析系统进行鉴定。结果见表 1。
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表 1 多种方法的鉴定结果 Tab.1 Results of multiphase identification |
文献[1, 6]报道，生化鉴定方法和16SrDNA基因序列均无法准确将洋葱伯克霍尔德菌鉴定到种。因此，在其他方法鉴定到属的基础上，进一步采用recA基因序列分析，并以此作为准确到种的鉴定结果，相关recA基因序列见表 2。将A组菌的代表菌0001-1鉴定为洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia），B组菌的代表菌0008-5鉴定为类洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderiaceno cepacia）。
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表 2 recA基因序列结果 Tab.2 Results of recA gene sequence |
综合来看，生理生化鉴定方法（API 20NE和Biolog）能够将洋葱伯克霍尔德菌和类洋葱伯克霍尔德菌鉴定到属的水平，16SrDNA序列分析也只能鉴定到属的水平，结合recA序列分析能够准确鉴定到种的水平。核糖体分型技术（Riboprinter）能够鉴定到属的水平，但是该方法能够对菌种进行溯源分析。
3.2 洋葱伯克霍尔德菌在药品检验常用培养基中的生长情况将鉴定为洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）的0001-1号菌按照“2.2”项所述方法，接种到相应液体和固体培养基中进行培养观察，结果见表 3和表 4。
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表 3 洋葱伯克霍尔德菌在液体培养基中的生长情况 Tab.3 Growth conditions of Burkholderia cepacia in liquid culture medium |
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表 4 洋葱伯克霍尔德菌在固体培养基中的生长情况 Tab.4 Growth conditions of Burkholderia cepacia in solid culture medium |
液体培养基的培养结果表明：非选择性增菌培养基如TSB、SDB或NB均能够支持该菌生长。MacB在33 ℃和25 ℃均能够支持该菌生长，但最好延长培养至48~72 h。当培养温度为33 ℃时，只有接种量达到103 cfu时，该菌在EE中才能够生长；当培养温度为25 ℃时，接种量达到102和103 cfu时，培养时间为48 h以上时，该菌在EE中才能够生长；而且，洋葱伯克霍尔德菌在EE中培养到96 h时，肉眼仍无法观察到混浊，只有通过划线培养才能够判断有菌生长；当延长培养时间至7 d时，才能够观察到混浊出现。RVS不支持该菌生长。
固体培养基的培养结果表明，洋葱伯克霍尔德菌在非选择性培养基TSA、SDA、NA和R2A培养基上均能够生长，而且在R2A培养基上生长速度最快。R2A培养基作为一种典型的寡营养培养基，是《中国药典》规定在纯化水和注射用水微生物限度检查时使用的计数培养基。有报道表明[8]，该菌能够在无营养的纯化水中存活超过40 d，与TSB、脑心浸液肉汤（Brain Heart Infusion Broth）、MH肉汤（Mueller-HintonBroth）相比，R2A肉汤更适宜该菌的生长；与营养丰富的TSA培养基相比，寡营养R2A培养基和稀释的TSA培养基更适合该菌的生长。同时，国内有报道在制药用水中曾经分离出该菌[9]。在选择性培养基VRBG和MacA上均能够生长，且会表现出典型的菌落形态。在CA上，33 ℃培养不生长，但是在25 ℃培养48 h以上生长，呈黄绿色大小不一的圆形光滑菌落。XLD不支持该菌生长。
上述培养特性与伯杰氏细菌系统分类学手册[10]的叙述基本一致：伯克霍尔德菌属的最适生长温度为30 ℃，许多种在37 ℃甚至40 ℃能够生长；其生长仅需要很少成分的培养基即可，不需要添加有机生长因子。洋葱伯克霍尔德菌能够利用超过100种有机物。自然界中，有些菌株生长极其缓慢，分离培养后，可被复杂的有机营养成分如酵母粉刺激然后生长。
3.3 抑菌剂的最小抑菌浓度和最低生长水分活度分别选取酚类（苯酚、间甲酚）、季铵盐类（苯扎氯铵、苯扎溴铵）、尼泊金酯类（羟苯甲酯、羟苯乙酯）以及双胍类（盐酸氯己定、醋酸氯己定），其最小抑菌浓度测定结果见表 5。季铵盐类化合物如苯扎氯铵或苯扎溴铵作为防腐剂被广泛用于药品和化妆品中。有研究表明，洋葱伯克霍尔德菌对苯扎氯铵有天然耐受性，其作用机理包括生物降解利用和主动外排的作用，苯扎氯铵对洋葱伯克霍尔德的最小抑菌浓度为50 µg·mL-1 [11-12]，与本研究所得结果32 µg·mL-1基本一致。本研究对象凝胶剂中含苯扎溴铵质量浓度为100 µg·mL-1，通过测定，苯扎溴铵对分离洋葱伯克霍尔德菌的最小抑菌浓度为64 µg·mL-1。
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表 5 最小抑菌浓度值 Tab.5 Minimum inhibitory concentration |
一定的水分活度是微生物生长的必要条件，通过测定，分离洋葱伯克霍尔德菌的最低生长水分活度为0.97（见表 6），这与假单胞菌属的最低生长水分活度值[13-14]基本一致。同时测定本凝胶剂的最低生长水分活度值为0.97左右。
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表 6 最低生长水分活度值 Tab.6 Minimum water activity for growth |
由上述分析可知，该凝胶剂有支持该菌生长的最低生长水分活度值，并且所含苯扎溴铵浓度与其最小抑菌浓度相当，鉴于该菌对苯扎溴铵有天然的耐受性，因此分离洋葱伯克霍尔德菌在该凝胶剂中有存活和进一步繁殖的可能。
4 结论从某凝胶剂中分离1株革兰氏阴性杆菌，通过生理生化和保守序列分析，鉴定为洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）。将该菌接入《中国药典》微生物限度检查用培养基中培养，表明在各非选择性培养基中均能够较好生长，特别是在寡营养培养基R2A琼脂中生长最为良好；在选择性培养基麦康凯液体、麦康凯琼脂和紫红胆盐琼脂培养基中能够生长良好；在EE肉汤中生长缓慢且肉眼无法观察到浑浊，十六烷培养基只有在低温（25 ℃）才能够支持该菌生长。结合该制剂中的苯扎溴铵浓度和水分活度值，通过测定苯扎溴铵的最小抑菌浓度和该分离菌的最低生长水分活度，判断该凝胶剂中污染的洋葱伯克霍尔德菌有进一步繁殖的可能，提示该产品存在一定的安全隐患，建议企业应考虑问题批次产品存在的风险，对该产品采取控制措施，并暂停生产，待查明原因解决问题后再恢复生产。
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