2019, Vol. 39 
磷酸二酯酶-5（PDE-5）是环核苷酸水解酶族的一种，能够调节细胞内环鸟甘酸（cGMP）水平，PDE-5抑制剂最初被作为治疗心绞痛和高血压的药物来研究，现在主要用于对阳痿的治疗[1-3]。目前，批准上市用于治疗阳痿的PDE-5抑制剂主要有西地那非、伐地那非、他达那非、乌地那非和敏瑞宁等[4]。PDE-5抑制剂服用时具有一定的禁忌和副作用，如头痛、消化不良、肌肉疼痛、视觉和听觉障碍等，消费者在不知情的情况下使用这些产品，可能引起严重的药物相互作用[5-6]。近年来，众多补肾壮阳类中药及保健食品中非法添加PDE-5抑制剂类的化学药物及其结构类似物以增加疗效，这类产品生产工艺不规范，非法添加成分含量差异大，有的远远超过安全剂量，有些成分因没有进行过安全性实验而存在很多未知危害因素，长期服用这类产品会给人们的身体健康造成及其严重的危害。定量核磁共振（quantitative nuclear magnetic resonance，qNMR）法与其他传统定量方法相比，有其独特的优势：定量同时给出结构信息、无需待测物的标准物质、样品预处理步骤简单、测定速度快、专属性强、不破坏样品等等[7-12]。
本文建立了测定那莫西地那非、豪莫西地那非、硫代西地那非和伪伐地那非（结构式见图 1）4种PDE-5抑制剂含量的qNMR法，对方法的线性、精密度、重复性以及样品溶液稳定性进行了考察，并将定量结果与质量平衡法的测定结果进行比较，结果表明，该方法准确、快速、可靠，为该类成分的含量测定和对照品的标定提供了新的方法。同时，本文对那莫西地那非的核磁数据进行归属和报道，为其结构确证提供参考。
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图 1 4种PDE-5抑制剂化学成分的结构 Fig.1 The chemical structures of four PDE-5 inhibitor |
Ascend-500型核磁共振波谱仪（布鲁克公司）；MSA 6.6S百万分之一电子天平（赛多利斯公司）。
1.2 试药对苯二甲酸二甲酯（含量99.9%，批号510052-201401）、那莫西地那非（含量99.5%，批号520040-201401）、豪莫西地那非（含量99.6%，批号520046-201401）、硫代艾地那非（含量99.5%，批号520048-201401）和伪伐地那非（含量99.0%，批号520041-201401）均购自中国食品药品检定研究院；氘代氯仿（CDCl3）（Sigma-Aldrich）；氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）（Sigma-Aldrich）。
2 方法与结果 2.1 供试品溶液制备精密称取那莫西地那非、豪莫西地那非、硫代艾地那非和伪伐地那非约20 mg，分别加入对苯二甲酸二甲酯约2 mg，再分别加入氘代氯仿0.5 mL使其完全溶解，转移至5 mm核磁管中备用。
2.2 核磁仪器参数设置采用90º脉冲，脉冲程序为noesyig1d，谱宽（SWH）设置为10 000 Hz，采样次数为64次，采样时间设置为3.28 s，采样点数为64 K，接收器增益设置为32，驰豫延迟时间设置为20 s。
2.3 数据处理与qNMR计算将采集得到的氢谱进行傅里叶变换，然后对谱图进行基线校正和相位校正。对选定的内标定量峰和待测物定量峰进行积分，每个峰积分5次，取积分面积的平均值，计算公式如下[13]：
| $ {P_{\rm{X}}} = \frac{{{A_{\rm{x}}} \times {N_{{\rm{std}}}} \times {M_{\rm{X}}} \times {m_{{\rm{std}}}}}}{{{A_{{\rm{std}}}} \times {N_{\rm{X}}} \times {M_{{\rm{std}}}} \times m}} \times {P_{{\rm{std}}}} $ |
其中Px、Pstd分别为待测物和内标物的含量；Ax、Astd分别为待测物和内标物定量峰积分面积；Nx、Nstd分别为待测物和内标物定量峰包含的质子数；Mx、Mstd为待测物和内标物的相对分子质量；m、mstd分别为待测物和内标物的称样量。
2.4 方法学考察 2.4.1 线性关系考察称取待测物与内标物适量，用氘代氯仿分别配制6份不同浓度溶液，按“2.2”项下条件测定，进行线性考察。以待测物定量峰与内标定量峰面积比值为纵坐标，以待测物与内标物的质量比值为横坐标，进行线性回归，得到4个线性方程。见表 1。
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表 1 回归方程及线性范围 Tab.1 Regression equations and linear ranges |
取供试品溶液，按“2.2”项下条件连续测定6次，以待测物定量峰面积与内标物定量峰面积的比值，计算那莫西地那非、豪莫西地那非、硫代艾地那非和伪伐地那非的RSD（n=6）分别为0.019%、0.15%、0.088%和0.18%。
2.4.3 重复性试验按“2.1”项下方法配制那莫西地那非、豪莫西地那非、硫代艾地那非和伪伐地那非供试品溶液各6份，按“2.2”项下条件进行测定，计算样品中含量值的RSD分别为0.27%（含量：99.02%、99.13%、99.47%、98.91%、99.56%和99.02%）、0.28%（含量：99.12%、99.35%、99.19%、99.10%、99.66%和99.74%）、0.18%（含量：99.20%、98.84%、99.07%、98.85%、99.28%和99.13%）和0.24%（99.19%、99.04%、99.64%、99.39%、99.22%和99.53%）。
2.4.4 稳定性试验分别取那莫西地那非、豪莫西地那非、硫代艾地那非和伪伐地那非的同一份供试品溶液，在0、3、6、9、12 h分别进行测定，计算待测物定量峰面积与内标物定量峰面积比值的RSD分别为0.022%、0.57%、0.40%和0.97%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.5 定量结果按“2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下条件进行测定，那莫西地那非、豪莫西地那非、硫代艾地那非和伪伐地那非的定量结果见表 2。根据质量平衡法，含量（%）=（100%–干燥失重值%–炽灼残渣值%）×HPLC纯度[12]，测定样品含量，结果见表 2。qNMR法含量测定结果与质量平衡法测定结果基本一致。
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表 2 定量核磁共振法与质量平衡法结果比较（%） Tab.2 The quantitative results of qNMR and mass balance method |
称取那莫西地那非约10 mg，溶于0.5 mL DMSO-d6中，测定其1H-和13C-NMR谱图，结果见表 3。
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表 3 那莫西地那非和豪莫西地那非的1H和13C-NMR数据 Tab.3 1H, 13C-NMR data for norneosildenafil and homosildenafil |
理想的溶剂应该对待测物和内标物都有较好的溶解性，不与待测物和内标物反应，且溶剂峰与待测物、内标物的定量峰不重叠。那莫西地那非、豪莫西地那非、硫代艾地那非、伪伐地那非以及对苯二甲酸二甲酯在CDCl3中都有较好的溶解性，并且待测物、内标物和CDCl3在1H-NMR谱图中信号无干扰。因此选择CDCl3作为溶剂。
3.2 内标物的选择内标物应含量准确，具有较高的纯度，化学性质稳定，易溶于所选定的溶剂，并且不与溶剂和待测物发生反应，内标物定量峰的化学位移不与待测物的化学位移重合。本实验中，对苯二甲酸二甲酯在CDCl3中稳定，不与那莫西地那非、豪莫西地那非、硫代艾地那非、伪伐地那非反应，且与待测物的吸收峰有较好的分离。
3.3 定量峰的选择通常选择与相邻峰无干扰且裂分较少的峰作为定量峰，并且内标与待测物的定量峰应在较为近似的射频场内，避免射频场的不同造成峰强度差异，从而引起的误差[15]。定量1H-NMR谱图中，那莫西地那非、豪莫西地那非和硫代艾地那非在δ8.81处，伪伐地那非在δ8.44处，内标物对苯二甲酸二甲酯在δ8.10处，均显示苯环上质子峰，与附近峰分离好且无干扰，因此选为定量峰（图 2）。
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1.那莫西地那非（norneosildenafil） 2.豪莫西地那非（homosildenafil） 3.硫代艾地那非（thioaildenafil） 4.伪伐地那非（pseudovardenafil） †.内标物定量峰（the monitored protons of internal standard） ‡.待测物定量峰（the monitored protons of the target compounds） 图 2 4种PDE-5抑制剂加入内标物后1H-NMR图谱 Fig.2 1H-NMR spectra of four PDE-5 inhibitor reference standards with internal standard |
驰豫延迟时间（D1）对核磁共振信号积分值的影响较大，定量实验中通常设定D1值不低于5倍的定量峰中最长的纵向弛豫时间（T1）值[16]。采用反转恢复实验，测量待测物和内标物定量峰在CDCl3中的T1值（表 4）。待测物定量峰和内标物定量峰T1为2.258~3.498 s，为保证每次采样质子能够充分驰豫，将D1设置为20 s。通常扫描次数与峰信噪比的平方根成正比，增加扫描次数以获得足够高的信噪比。但扫描次数增加会延长实验时间。实验发现当扫描次数不小于64次时，图谱信噪比满足要求且数据比较稳定，因此本实验选择扫描次数为64。
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表 4 待测物和内标物定量峰在CDCl3中的T1值 Tab.4 The T1 values of monitored protons |
本文建立了那莫西地那非、豪莫西地那非、硫代艾地那非和伪伐地那非的qNMR方法，并对该方法的线性、精密度、重复性和稳定性等进行了考察，结果均显示良好。质量平衡法是化学对照品最为常用的定值方法，本文将qNMR法的定值结果与质量平衡法的结果进行比较，2种方法测定结果基本一致。综上所述，本文建立的测定4种PDE-5抑制剂成分含量的qNMR法，具有准确度高，操作简单、快捷等优点，为该类成分的含量测定和对照品的标定提供了新的测定方法。
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