2019, Vol. 39 
2. 杭州医学院, 杭州 310053;
3. 浙江康恩贝制药股份有限公司, 浙江省中药制药技术重点实验室, 杭州 310052
2. Hangzhou Medical College, Hangzhou 310053, China;
3. Zhejiang Conba Pharmaceutical Co., Ltd. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pharmaceutical Technology in TCM, Hangzhou 310052, China
“宝根1号方”由上海市名老中医、儿科专家徐蔚霖主任医师集数十年临床经验创立，具有补脾益肺，实后天之根本，调和营卫，固御敌之藩篱的作用，临床用于治疗肺脾两虚型小儿反复呼吸道感染，疗效显著[1]。“宝根1号方”由党参、沙参、白术、白芍、当归、生地、豆蔻、炙远志、五味子、生牡蛎、甘草等药材组成，方中党参、沙参两者相伍补气滋阴为君药，白术配白芍，益脾气助脾阳以柔相济，生地黄、当归养阴补血共为臣药，五味子、远志宁心安神，共为佐药，白豆蔻芳香醒脾，牡蛎潜阳敛阴为使药，全方健脾益气、和营敛汗、益肺化痰，温而不燥、补而不腻、攻而不竣，可达缓则治其本的功效，符合哮喘缓解期扶正固本治则。“宝根1号方”临床上能够有效改善患儿机体状态，明显提高机体免疫力，增强抗病能力，改善体质，以发挥正常的抗感染及免疫调节作用，从而达到防治反复呼吸道感染的目的[2]。
目前尚未见“宝根1号方”的HPLC质量控制方法报道。现代研究表明：“宝根1号方”中党参可提高机体血液中免疫球蛋白含量，增强免疫力，改善微循环[3-4]；当归的阿魏酸对感冒病毒、呼吸道合胞体病毒有显著抑制作用[5]；芍药中的芍药苷具有浓度和机能依赖性的双向免疫调节功能[5]；甘草酸、甘草苷具有非特异性免疫调节、抗炎和抗病毒作用[6-7]；炙远志中的寡糖酯类成分可显著延长小鼠咳嗽潜伏时间和减少小鼠的咳嗽次数，显著增加小鼠气管的酚红吸光度，是镇咳祛痰的功效成分[8-9]。以5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、3，6’-二芥子酰基蔗糖和甘草酸作为“宝根1号方”的含量测定指标，因其提高机体免疫力，增强抗病能力与防治反复呼吸道感染的作用机理密切相关，可以较全面地反映“宝根1号方”的质量。本研究建立HPLC波长切换法同时测定“宝根1号方”中上述6个主要功效成分的含量，为该中药复方的质量控制和研究应用提供科学依据。
1 仪器与试药Waters 2695型高效液相色谱仪（Waters公司），包括2996 PDA检测器、自动进样器、四元梯度泵、Empoer 3色谱工作站；METTLER MS105DU电子天平；SK7210LHC数控超声波清洗器（功率350 W，频率53 kHz，上海科导超声仪器有限公司）。
对照品5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、3，6’-二芥子酰基蔗糖、甘草酸购于上海盛中医药化工有限公司，纯度均≥98%；乙腈、磷酸、甲酸为色谱纯；水为超纯水；其余溶剂为分析纯。“宝根1号方”（批号20180316、20180411、20180425）由上海市儿童医院药剂科中药房提供。
2 方法与结果 2.1 色谱条件与系统适用性试验 2.1.1 色谱条件采用Dikma C18柱（4.6 mm×250 mm，5 mm），以乙腈为流动相A，0.1%磷酸水为流动相B，梯度洗脱（0~20 min，5%A→10%A；20~40 min，10%A→21%A；40~45 min，21%A；45~50 min，21%A→26%A；50~60 min，26%A→40%A；60~66 min，40%A；66~70 min，40%A→95%A），流速为1.0mL·min-1，柱温为35 ℃，采用波长切换方式检测（0~10 min为280 nm，10~70 min为240 nm），进样量10 mL。本文色谱条件下的色谱图见图 1。结果显示，空白溶剂和样品中的杂质不干扰指标成分的测定。
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1. 5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfura）2.芍药苷（paeoniflorin）3.阿魏酸（ferulic acid）4.甘草苷（liquiritin）5. 3，6’-二芥子酰基蔗糖（3，6’-disinapoyl sucrose）6.甘草酸（glycyrrhizic acid） 图 1 阴性对照（A）、混合对照品（B）和样品（C）色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of negative control(A), mixed reference substances(B)and sample(C) |
精密吸取混合对照品溶液10 µL，按上述色谱条件进样，记录色谱图。理论塔板数按芍药苷色谱峰计算不低于5 000，各指标成分的分离度应不小于3。连续进样5次，5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、3，6’-二芥子酰基蔗糖和甘草酸峰面积的RSD分别为0.46%、0.34%、0.82%、1.2%、1.0%、0.45%。
2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品储备液精密称取各对照品适量，分别加甲醇制成每1 mL含5-羟甲基糠醛82.2 mg，芍药苷2 120 mg，阿魏酸96.8 mg，甘草苷371 mg，3，6’-二芥子酰基蔗糖387 mg和甘草酸728 mg的溶液，作为各对照品的储备液。精密吸取各储备液1 mL，置于10 mL量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液。
2.2.2 供试品溶液取本品粉末（过3号筛）0.4 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称量，水浴回流60 min，放冷，再称量，用70%甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3 线性关系考察精密吸取混合对照品储备液适量，加甲醇稀释配制成系列浓度的混合对照品溶液。准确吸取各混合对照品溶液10 µL，按上述确定的色谱条件测定峰面积，以对照品质量浓度X（mg·mL-1）为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线，得到6个成分的线性回归方程及线性范围，见表 1。
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表 1 线性关系考察结果 Tab.1 The results of calibration |
将混合对照品储备液适当稀释，制得一系列不同浓度的溶液，进行分析，以信噪比为3:1确定5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、3，6’-二芥子酰基蔗糖和甘草酸的检测下限分别为0.013、0.066、0.011、0.024、0.025、0.047 µg·mL-1；以信噪比为10:1确定上述6个成分的定量下限分别为0.032、0.110、0.038、0.058、0.060、0.114 µg·mL-1。
2.5 精密度试验准确吸取同一供试品溶液10 µL，连续进样6次测定，求得5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、3，6’-二芥子酰基蔗糖和甘草酸峰面积的RSD分别为0.49%、0.43%、1.2%、1.1%、1.0%、1.3%，表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验准确吸取同一供试品溶液10 µL，分别在0、2、4、6、8、12、18、24 h进样测定，5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、3，6’-二芥子酰基蔗糖和甘草酸峰面积的RSD分别为0.70%、0.50%、1.6%、1.3%、1.0%、1.5%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.7 重复性试验取同一批样品（批号20180425）6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、3，6’-二芥子酰基蔗糖和甘草酸的含量分别为0.081、2.341、0.133、0.371、0.285、0.919 mg·g-1，RSD分别为1.5%、0.41%、0.27%、1.6%、1.1%、1.8%，表明该方法重复性良好。
2.8 加样回收率试验精密称取已知5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、3，6’-二芥子酰基蔗糖和甘草酸含量的样品（批号20180425）粉末0.2 g，6份，分别精密加入各组分对照品溶液适量（加入量为样品已知含有量的100%），按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，进样测定，结果见表 2。
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表 2 加样回收率试验考察结果（n=6） Tab.2 Results of recovery tests |
按照本文条件，分别测定3批“宝根1号方”样品，记录5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、3，6’-二芥子酰基蔗糖和甘草酸的色谱峰峰面积，根据回归方程计算各组分含量，结果见表 3。
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表 3 含量测定结果（mg·g-1） Tab.3 Results of content determination |
目前已有学者建立了高效液相色谱法测定逍遥丸中芍药苷、阿魏酸、甘草苷和甘草酸的含量，采用乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱，紫外检测器多波长检测[10]。也有学者建立了高效液相色谱法测定芍枣胶囊中芍药苷、3，6’-二芥子酰基蔗糖的含量，采用乙腈-水梯度洗脱，蒸发光散射检测器检测[11]。尚未见“宝根1号方”的质量控制方法报道。
本研究分别考察了不同提取溶剂（甲醇、70%甲醇）、提取方法（超声法、回流法）、提取时间（30、60 min）、提取溶剂用量（25、50 mL）对各指标成分的色谱峰峰面积的影响，确定了本文的供试品溶液制备方法。
本法测定了各成分的紫外吸收图谱，5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、3，6’-二芥子酰基蔗糖和甘草酸的最大吸收波长分别为282、230、233、274、238和250 nm，因此选择波长切换方式，0~10 min以280 nm测定5-羟甲基糠醛的含量，10~70 min以240 nm测定其余成分的含量，实现了6个成分的同时测定。
在流动相的选择中，考察了甲醇、乙腈、0.1%甲酸水、0.05%磷酸水、0.1%磷酸水的多种流动相系统，结果显示乙腈-0.1%磷酸水作为流动相，具有最好的峰形和最低的基线噪音，这也是《中华人民共和国药典》2015年版一部收载的芍药苷含量测定用流动相[12]。为使芍药苷得到更好的峰形，考察了Agilent ZORBAX SB-C18、Agilent Eclipse XDB-C18、Dikma C18和Spursil C18等不同色谱柱，结果显示，采用这些色谱柱，芍药苷的峰形相近，故而这些色谱柱均可用于本方法的含量测定[13-14]。
同时考察了不同流速、不同柱温等条件对色谱分离的影响，结果表明，色谱条件的微小变化对测定结果影响不大，说明本方法具有较好的耐用性。
本文建立的“宝根1号方”HPLC含量测定法操作简便，耐用性好，具有较好的适用性与可靠性，可以用于“宝根1号方”的质量控制，并为该中药复方的进一步研究和应用奠定科学基础。
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