利尿剂是一类能促进体内电解质和水分排出而增加尿量的药物，在临床上用于治疗水肿和高血压，增加尿的排泄量。目前市面上利尿剂主要有4类，噻嗪类利尿剂、保钾利尿剂、袢利尿剂和磺胺类利尿剂。噻嗪类利尿剂主要是氢氯噻嗪，保钾利尿剂主要有氨苯蝶啶和螺内酯，袢利尿剂主要有呋塞米、托拉塞米，磺胺类利尿剂有吲达帕胺。利尿剂是治疗高血压和心力衰竭的关键药物，疗效明确。然而，不法商贩为谋取利益，在一些中成药或保健品中擅自添加利尿剂，使一些中老年患者在不知情的情况下服用此类药物，易引起血压突然降低或剧烈波动，加重患者的病情，引起肾损害或中风等风险，给医师诊断和用药带来干扰和风险。同时，由于病患个体差异，医师用药后也需要及时了解利尿剂在人体中的代谢情况，为进一步用药提供诊断数据。因此，有必要建立一种快速检测人血浆中常见利尿剂的检测方法，为临床医师提供判断依据。

目前，利尿剂的检测方法主要是液相色谱法(LC法)^[1-5]、气相色谱质谱法(GC-MS法)^{[1, 6]}和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS法)^[7-16]。LC法通量和灵敏度低，检测周期长，受基质干扰大，已经不能满足临床血浆检验中关于利尿剂残留的检测需求；GC-MS仪是最早商品化的联用仪器，只能分析分子量小，易挥发，热稳定和能气化的化合物，限制了在利尿剂方面的应用；LC-MS/MS法可以提供检测化合物的结构信息，具有高通量和高选择性，可以同时检测血浆中多种利尿剂。由于血浆样品中残留的利尿剂含量低，基质干扰大，利尿剂和血浆蛋白结合率高，如呋塞米与血浆蛋白结合率超过了90%以上，如果不处理而直接检测，很容易被未检出数据误导，因此急需建立可行的前处理技术以及灵敏度高的检测方法。本研究以市场上常见的利尿剂为研究对象，引用生物酶处理样品，将利尿剂和结合蛋白水解游离，结合QuEChERS净化前处理提取方法，建立了人血浆中6种常见利尿剂的快速LC-MS/MS测定方法。该方法简单方便，灵敏，检测时间短，为医师诊断疾病和用药提供了有效的数据支持。

1 实验部分 1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-质谱联用仪:AB eksigent ultra LC100-XL/Qtrap 5500(AB公司)，配电喷雾离子源(ESI)；5810R型离心机(Eppendorf公司)；N-EVAP氮吹仪(Organomation Associates公司)；Milli-Q纯水机(Millipore公司)；Cleanert PCX-SPE净化柱(天津博纳艾杰尔公司)；MS3基本型旋涡混匀器(德国IKA公司)。

对照品氢氯噻嗪、呋塞米、托拉塞米、螺内酯、吲达帕胺和氨苯蝶啶购于欧洲药典标准品采购中心(含量 > 99%)；β-葡萄糖醛苷酶购于德国Merck公司；中性氧化铝(Alumina-N，100~200目)购于天津市科密欧公司，石墨炭黑粉(GCB，120~400目)、C₁₈粉(ODS，50 μm)、PSA粉(PSA，40~60 μm)和氨丙基粉(NH₂，40~60 μm)均购于Agela Technologies Inc公司；乙腈和甲酸均为色谱纯，购于Biopure公司；实验所用水为超纯水，电导率≤0.01 mS·m^-1。C₁₈柱(Eclipse Plus C₁₈，3.0 mm×100 mm，1.8 μm)和C₁₈柱(Eclipse XDB C₁₈，3.0 mm×100 mm，1.8 μm)购于Agilent公司。ACQUITY UPLC BEH HILLIC柱(HILLIC，2.1 mm×100 mm，1.7 μm)购于Waters公司。

1.2 对照品溶液的配制

准确称取各化合物对照品0.01 g，分别置100 mL量瓶中，先用少量甲醇溶解，再用甲醇定容至刻度，得质量浓度均为100 μg·mL^-1的对照品储备液；准确移取各对照品储备液1 mL，分别置10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，得质量浓度均为10 μg·mL^-1的对照品中间液；准确取各对照品中间液10 mL，置100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，得质量浓度为1 000 ng·mL^-1的混合对照品工作液。

1.3 色谱条件

色谱柱:Eclipse Plus C₁₈(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相A为水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱(0~5 min，15%B→70%B；5~5.1 min，70%B→15%B；5.1~8.5 min，15%B)；流速:0.3 mL·min^-1；柱温:40 ℃；进样体积:10 μL。

1.4 质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI)；扫描方式:正负离子同时扫描；监测方式:动态多反应监测；气帘气:220.64 kPa；离子电压:5 500 V；碰撞气:氮气；干燥气温度:550 ℃；喷雾气(GS1):379.225 kPa；辅助雾化器(GS2):379.225 kPa；6种利尿剂的质谱检测参数见表 1。

1.5 样品处理

准确移取待测血浆样品2 mL，置于50 mL具塞离心管内，加入β-葡萄糖醛苷酶20 μL，水浴37 ℃振荡4 h，再依次加入乙腈0.5 mL，于旋涡混匀器旋涡震荡均匀，下加20 mL提取溶剂(将乙酸乙酯60 mL、乙醚30 mL和异丙醇10 mL混合均匀，即得)涡旋混合1 min，离心(4 ℃，10 000 r·min^-1)10 min，取上层溶液10 mL，置15 mL干净玻璃试管中，35 ℃水浴下氮气吹干，在玻璃管中加入ODS粉100 mg和NH₂粉50 mg，1 mL定容液[乙腈-水(15:85)]，旋涡振荡1 min，经0.22 μm双系滤膜过滤，供LC-MS/MS分析测定。

2 结果与讨论 2.1 色谱条件的优化

色谱条件优化的目的主要是消除基质的干扰，将利尿剂良好分离。常用的有机溶剂有甲醇^{[5, 7-8, 13-15]}和乙腈^{[4, 9-12, 16-17]}，本文考察了2种溶剂对6个化合物的影响。试验发现，当有机相为乙腈时，6个化合物的响应值均比用甲醇为有机相的响应值提高30%以上，和文献[17]的结论相同。虽然6个化合物都属于利尿剂，但分子质量和化学性质差异较大，如螺内酯和氨苯蝶啶正离子扫描响应值高，其他4个化合物负离子扫描响应值高。水相中加酸或加碱都会抑制一些利尿剂的灵敏度，考虑到方法的通用性，最终确定水相为纯水。试验同时考察了3种C₁₈柱对利尿剂的影响，结果发现，Eclipse Plus C₁₈对6个化合物均有良好的分离，响应值最好。

2.2 质谱条件的优化

分别将6个化合物的1 μg·mL^-1单一对照品中间液通过自动进样泵以10 μL·min^-1直接注入ESI离子源，比较各化合物剂以正离子模式扫描和负离子模式扫描的响应值，确定扫描模式后分别优化其他质谱参数，得到碎片离子信息，优化的MRM质谱参数见表 1。图 1为6个化合物混合对照品溶液(2 μg·L^-1)在MRM模式下的质谱图。

2.3 提取条件的优化

利尿剂成分多样，化合物性质区别很大，如托拉塞米溶于水，螺内酯和吲达帕胺在水中几乎不溶解，因此选用提取试剂时需要综合考虑，根据提取利尿剂的不同，一般选用的提取试剂有甲醇^{[4, 11, 13, 15]}、二氯甲烷^[1]、乙酸乙酯^{[1, 7, 10]}或乙酸乙酯-异丙醇混合溶液^[14]。试验考察了甲醇-水(1:1)溶液、二氯甲烷溶液和乙酸乙酯溶液对利尿剂的回收率影响，经质谱检测，二氯甲烷溶液和乙酸乙酯溶液对化合物提取回收率都好于甲醇水，考虑到二氯甲烷毒性大，提取回收率和乙酸乙酯没有明显差异，初步确定用乙酸乙酯。进一步考察了乙酸乙酯混合溶液对回收率的影响，在乙酸乙酯中添加不同比例的乙醚和异丙醇，试验发现2种试剂的添加都提高了目标物的回收率，6个化合物的回收率由51.3%左右分别提高到65.1%以上，通过不同的比例组合验证，最终选用乙酸乙酯-乙醚-异丙醇(6:3:1)作为提取溶剂，6个化合物提取回收率均提高到80%以上。

2.4 净化方式的选择

血浆样品复杂，直接采用提取溶剂浓缩后经质谱检测干扰较多，样品中的蛋白、肌酸、氨基酸、胆红素、脂肪等成分干扰利尿剂的检测，尤其是呋塞米和螺内酯，在低浓度时受基质影响比较严重。目前常用的净化方法是固相萃取法，但是由于6个化合物酸碱性质差异，单纯用一种固相萃取柱很难对不同性质的6个化合物同时净化，而且增加了检测成本。本文参考文献^[18]，引用QuEChERS净化方法，考察了Alumina-N、GCB、ODS、PSA、NH₂ 5种净化粉对6个化合物的吸附回收率，发现ODS净化回收率在85.1%~89.5%，NH₂净化回收率在78.7%~87.3%，2种净化粉回收率较好；而Alumina-N、GCB和PSA对6个化合物吸附非常严重，故而不能使用，见表 2。ODS除色素、甾醇能力较好，NH₂粉可除去基质中的极性干扰物如有机酸、糖以及色素，通过对2种净化粉不同组合比例添加后净化6个化合物回收率的对比，确定了“1.5”项下用量为最佳净化条件。

2.5 标准曲线及检测下限

适当稀释混合对照品工作液，对6个化合物质量浓度在1.0~250.0 μg·L^-1之间的系列混合对照品溶液进行测定，以各化合物定量离子峰面积的平均值(Y)对其质量浓度(X，μg·L^-1)绘制标准曲线，其相关系数(r)均大于0.996。在人血浆中添加系列浓度的混合化合物对照品，以信噪比(S/N)为3作为方法的检测下限(LOD)，信噪比(S/N)为10作为方法的定量下限(LOQ)，结果见表 3。

2.6 回收率和精密度

在空白血浆样品中添加6个化合物对照品定量下限1倍、2倍、10倍3个水平的混合对照品，进行加标回收试验。按“2.5”项下方法绘制标准曲线，将空白血浆按“1.5”项下实验步骤进行操作，每个添加浓度水平平行配制6份。结果6个化合物的回收率在75.2%~90.6%之间，RSD在3.2%~8.1%之间，见表 4。

2.7 血浆样品测定

选取10名健康成年男性志愿者(25~40岁之间)，口服吲达帕胺2.5 mg，应用本文建立方法进行药物代谢动力学试验。在志愿者口服吲达帕胺1 h后血药浓度最高(平均为65.3 μg·L^-1)，随之急速下降，24 h后平均血药浓度为19.4 μg·L^-1，96 h时为3.2 μg·L^-1，120 h后所有志愿者血浆中已检测不到这6个化合物，和文献[7]报道的吲达帕胺代谢情况基本吻合。

3 结论

本文建立了1种基于生物酶处理和QuEChERS粉净化的人血浆前处理技术，结合超高效液相色谱-串联质谱，快速测定人血浆中氢氯噻嗪、呋塞米、托拉塞米、螺内酯、吲达帕胺和氨苯蝶啶6个常见化合物，能够对这6个化合物同时进行定性、定量分析。该方法具有灵敏、高效、操作性强等优点，可以满足人血浆中这6个化合物的检测要求，为临床诊断和治疗提供技术支持。