新疆一枝蒿不同极性部位体外抗炎作用的谱-效关系分析

生物检定·活性分析

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蔡晓翠, 毛艳, 贺金华, 李丽丹. 新疆一枝蒿不同极性部位体外抗炎作用的谱-效关系分析[J]. 药物分析杂志, 2019, 39(9): 1580-1589. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.09.06.

CAI Xiao-cui, MAO Yan, HE Jin-hua, LI Li-dan. Spectrum-activity relationship of anti-inflammatory effect in vitro of different polar parts of Artemisia rupestris L.[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2019, 39(9): 1580-1589. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.09.06.

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基金项目

新疆维吾尔自治区公益性科研院所基本科研业务经费资助项目(KY2017134);新疆维吾尔自治区柔性人才引进项目(2016);新疆维吾尔自治区卫生计生委青年医学科技人才专项(WJWY-201961)

第一作者

蔡晓翠, (0991)2326572;E-mail:cxcmaro@sina.com。

通信作者

贺金华, (0991)2326572;E-mail:3182410@qq.com

文章历史

收稿日期：2018-10-11

Contents Abstract Full text Figures/Tables PDF

新疆一枝蒿不同极性部位体外抗炎作用的谱-效关系分析

蔡晓翠 ^1,2, 毛艳 ¹, 贺金华 ¹, 李丽丹 ²

1. 新疆维吾尔自治区药物研究所, 乌鲁木齐 830004;
2. 新疆医科大学, 乌鲁木齐 830011

收稿日期：2018-10-11

基金项目：新疆维吾尔自治区公益性科研院所基本科研业务经费资助项目(KY2017134);新疆维吾尔自治区柔性人才引进项目(2016);新疆维吾尔自治区卫生计生委青年医学科技人才专项(WJWY-201961)

第一作者：蔡晓翠, (0991)2326572;E-mail:cxcmaro@sina.com

通信作者：贺金华, (0991)2326572;E-mail:3182410@qq.com

摘要：目的：研究新疆一枝蒿不同极性部位指纹图谱与体外抗炎作用的相关性，为揭示其抗炎作用物质基础提供依据。方法：采用高效液相色谱法建立新疆一枝蒿不同极性提取物及洗脱物的指纹图谱; 以巨噬细胞RAW264.7为研究对象，考察新疆一枝蒿不同极性提取物及洗脱物对细胞上清液中一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)和转录因子(NF-κB)的抑制作用，比较其抗炎活性差异; 采用灰色关联度分析法建立谱-效关系。结果：新疆一支蒿不同极性提取物及洗脱物的指纹图谱有明显差异性，从HPLC指纹图谱中确定18个共有峰。体外抗炎结果显示，不同极性提取物及洗脱部位的抗炎作用存在显著差异，其中50%乙醇提取物的30%洗脱部位对体外炎症因子的抑制作用最强。谱-效结果分析，对药效贡献较大的峰为5个共有峰，分别为1、2、5、9、11号。结论：建立了新疆一支蒿的HPLC指纹图谱及其体外抗炎活性的谱-效关系，并确定了抗炎活性的主要有效成分，为该药材的药效物质基础研究提供参考。

关键词：新疆一枝蒿提取物洗脱物指纹图谱谱效关系体外抗炎

Spectrum-activity relationship of anti-inflammatory effect in vitro of different polar parts of Artemisia rupestris L.

CAI Xiao-cui^1,2, MAO Yan¹, HE Jin-hua¹, LI Li-dan²

1. Xinjiang Institute of Materia Medica, Urumqi 830004, China;
2. Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China

Abstract: Objective: To study the correlation between fingerprints and the anti-inflammatory effect in vitro of different polar parts of Artemisia rupestris L., so as to reveal the material base of efficacy.Methods: HPLC was constructed to establish fingerprints of different polar extracts and eluates from Artemisia rupestris L. Using macrophage RAW264.7 as object, the inhibitory effects against NO, tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-6(IL-6), interleukin-10(IL-10)and transcription factors(NF-κB)were investigated and anti-inflammatory effects of different parts were compared. The grey correlation analysis method was used to establish the spectrum-activity relationship.Results: The fingerprint of different polar extracts and eluates from Artemisia rupestris L. showed significant difference. 18 common peaks were determined. In vitro anti-inflammatory results indicated that the anti-inflammatory effects of different polar extracts and eluates were significant different. Among them, 30% eluate from 50% ethanol extract had the strongest effect. Analysis of spectrum-activity relationship showed that 5 components had greater contribution to the effect, the peaks ranked as No.1, 2, 5, 9 and 11.Conclusion: The spectrum-activity relationship of fingerprint and anti-inflammatory effect in vitro are established and the main anti-inflammatory components are identified, which providing reference for its study on therapeutic material basis.

Keywords: Artemisia rupestris L. extracts eluate fingerprint spectrum-activity relationship anti-inflammatory in vitro

中药谱效关系是建立在指纹图谱基础上，将指纹图谱和药效学通过化学计量学模型进行关联，建立综合评价化学成分与药效活性评价为一体的质量评价模式，能够揭示化学成分与药效之间的相关性，指导和加速中药活性物质基础的研究，为提升中药的内在品质提供保障。近年来，中药谱效关系在许多中药和复方的药效物质基础研究中都有应用^[1-2]。

新疆一枝蒿(Artemisia rupestris L.)为菊科植物岩蒿的地上部分或全草，主要分布于我国新疆天山、阿勒泰等地区，哈萨克斯坦、蒙古、俄罗斯等亦有分布。新疆一枝蒿，维吾尔名为“一孜乎艾曼尼”，是维吾尔族医学传统用药，具有清热退烧、消炎止痛、健胃消食、凉血解毒、活血化淤之功效，主治热性或胆液质性或血液质性疾病，其化学成分主要包括黄酮类、倍半萜类、挥发油类、生物碱类等^[3-5]，现代药理学研究表明，新疆一枝蒿具有抗炎、抗过敏、保肝、抗肿瘤等药效作用^[6-7]。目前，对新疆一枝蒿的研究仅仅是单方面研究化学成分或者药理作用，尚未从整体化学组分水平研究其抗炎相关性物质，无法全面、系统地表征新疆一枝蒿抗炎药效物质基础。本研究运用体外细胞培养技术，检测了新疆一枝蒿不同极性提取物及不同洗脱物体外抗炎的生物活性；初步将HPLC指纹图谱和体外药效实验结果相结合，采用灰色关联度统计分析方法对“谱-效关系”进行了研究；考察新疆一枝蒿不同极性提取物及洗脱物HPLC指纹图谱特征峰对体外炎症因子抑制作用的相关性，确定各成分对药效的贡献；通过谱-效关系研究，阐明一枝蒿抗炎作用的药效物质基础，进一步得到新疆一枝蒿的抗炎有效部位，为后期深度开发和利用提供理论依据。

1 实验材料 1.1 仪器

Agilent 1260系列高效液相色谱仪(Agilent Technologies公司)；Agilent TC-C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；BioTek酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；BP211D电子天平(Sartorius公司)；BPN-CH型CO₂培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2 试药

新疆一枝蒿药材(新疆阿尔泰地区，野生，2017年8月采收)，由新疆维吾尔自治区药物研究所何江副研究员鉴定为菊科植物新疆一枝蒿(Artemisia rupestris L.)的地上部分或全草；一枝蒿酮酸对照品(批号20170710，含量测定按99.9%计)，购自中国科学院新疆理化技术研究所；对照品绿原酸(批号110753-201415，含量测定按96.8%计)、木犀草素(批号111520-200504，含量测定按99.6计)、紫花牡荆素(批号111554-201304，含量测定按98.3%计)、洋艾素(批号11879-201001，含量测定按97.2%计)、山柰素(批号110861-201611，含量测定按95.5%计)、芹菜素(批号111901-201102，含量测定按99.2%计)均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯；水为纯化水。

RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞株，ATCC)；1640培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；细胞活力检测试剂MTS(美国Promega公司，批号0000282236)；双抗(美国Hyclone公司，批号J140027)；Griess试剂盒(美国Promega公司，批号0000279666)；小鼠TNF-α ELISA试剂盒(批号EK0527)、小鼠IL-6 ELISA试剂盒(批号EK0411)和小鼠IL-10 ELISA试剂盒(批号EK0417)，博士德生物公司；小鼠NF-κB ELISA试剂盒(Cloud-Clone Corp公司，批号SEB824Mu)。

1.3 细胞

小鼠单核巨噬细胞株(RAW264.7细胞，购自ATCC公司)。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent TC C₁₈(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A为甲醇，B为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱(0~10 min，5%A→25%A；10~80 min，25%A→85%A；80~90 min，85%A→95%A)；流速:1.0 mL·min^-1；柱温:30 ℃；检测波长:250 nm；进样量:10 μL。

2.2 溶液制备 2.2.1 混合对照品溶液

精密称取一枝蒿酮酸、紫花牡荆素、洋艾素、山柰素、绿原酸、木犀草素和芹菜素的对照品适量，分别加甲醇制成每1 mL分别含42、50、44、15、40、1.04、0.020 μg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

称取新疆一枝蒿药材各50 g，粉碎，分别加入350 mL的水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇溶液，加热回流提取3次，每次1 h，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至干浸膏，备用，样品编号为S₁~S₅；称取样品S₃ 50 g，加水2 mL混合溶解后，上聚酰胺层析柱，分别加水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇溶液各6 L洗脱，收集其洗脱部位，减压浓缩至干浸膏，备用，样品编号为S₆~S₁₀；称取样品S₅ 50 g，加水2 mL混合溶解后，上聚酰胺层析柱，分别以水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇溶液各6 L洗脱，收集其洗脱部位，减压浓缩至干浸膏，备用，样品编号为S₁₁~S₁₅。取上述15种提取物或洗脱物各0.1 g，精密称定，分别置25 mL量瓶中，加相应提取溶剂溶解并定容，超声(功率250 W，频率40 kHz)至完全溶解，放冷，摇匀，0.45 µm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察^[7-9] 2.3.1 精密度考察

取样品(S₃)1份，按“2.2.2”项下方法制得供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，结果各共有峰相对保留时间的RSD(n=6) < 0.5%，相对峰面积的RSD(n=6) < 4.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性考察

取同一样品(S₃)6份，按“2.2.2”项下方法制得供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果各共有峰相对保留时间的RSD(n=6) < 0.5%，相对峰面积的RSD(n=6) < 4.0%。表明方法重复性良好，符合指纹图谱研究技术的要求(RSD≤5%)。

2.3.3 稳定性考察

取样品(S₃)1份，按“2.2.2”项下方法制得供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、3、6、9、12、24 h进样，考察各共有峰相对保留时间的一致性。结果表明，24 h内各共有峰相对保留时间的RSD(n=6) < 0.5%，相对峰面积的RSD(n=6) < 4.0%。表明供试品溶液室温放置24 h稳定。

2.4 指纹图谱的研究 2.4.1 HPLC指纹图谱的建立

将新疆一枝蒿5个不同极性提取物及10个不同极性洗脱物按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样，记录色谱图及各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，得到15个指纹图谱。确定了18个共有峰，其中11号峰化学性质稳定，保留时间及峰面积重复性良好，且峰面积较大，与其他相邻峰分离良好，因此选择11号峰为指标峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，代表性图谱见图 1。实验结果表明，各共有峰的相对保留时间较为一致(RSD均小于1.0%)，但相对峰面积差异较大(RSD均大于100%)，表明主成分含量差异性较大。

图 1 新疆一枝蒿(S₅)的HPLC图谱 Fig.1 HPLC chromatogram of sample(S₅)

2.4.2 共有峰的确认

采用对照品对照，共确定了7个共有峰代表的化学成分，1、10、11、12、13、15、17号峰分别为绿原酸、木犀草素、一枝蒿酮酸、山柰素、芹菜素、紫花牡荆素、洋艾素，色谱图见图 2。

1.绿原酸(chlorogenic acid) 2.木犀草素(luteolin) 3.一枝蒿酮酸((rupestonic acid) 4.山柰素(kaempferide) 5.芹菜素(apigenin) 6.紫花牡荆素(casticin) 7.洋艾素(absinthin) 图 2 对照品的HPLC图谱 Fig.2 HPLC chromatogram of standards

2.4.3 指纹图谱分析

将经过积分处理的样品色谱图“AIA文件”导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版软件，以样品S₃的图谱为参照图谱，设定时间窗为0.1 min。采用中位数法，按Mark峰进行自动匹配，生成对照指纹图谱，并进行相似度分析，结果见图 3、表 1。结果显示15个样品相似度较低，提示不同极性提取物及洗脱物化学成分差异较大，可为新疆一枝蒿抗炎谱-效关系的研究提供数据基础。

图 3 新疆一枝蒿不同极性提取物及洗脱物的指纹图谱 Fig.3 Fingerprints of extracts and eluates with different polarities from A. rupestris

表 1 新疆一枝蒿不同极性提取物及洗脱物指纹图谱相似度 Tab.1 Similarities of the fingerprint of extracts and eluates with different polarities from A. rupestris

样品(sample)	S₁	S₂	S₃	S₄	S₅	S₆	S₇	S₈	S₉	S₁₀	S₁₁	S₁₂	S₁₃	S₁₄	S₁₅	对照(reference)
S₁	1.00	0.97	0.95	0.95	0.91	0.97	0.97	0.52	0.98	0.35	0.35	0.94	0.86	0.91	0.35	0.93
S₂	0.97	1.00	1.00	1.00	0.96	0.94	0.95	0.69	0.95	0.48	0.47	0.91	0.93	0.96	0.53	0.98
S₃	0.95	1.00	1.00	1.00	0.96	0.92	0.94	0.71	0.94	0.50	0.50	0.89	0.93	0.96	0.56	0.98
S₄	0.95	1.00	1.00	1.00	0.96	0.92	0.94	0.71	0.94	0.49	0.50	0.89	0.94	0.96	0.56	0.98
S₅	0.91	0.96	0.96	0.96	1.00	0.94	0.94	0.65	0.93	0.38	0.40	0.94	0.97	0.99	0.57	0.99
S₆	0.97	0.94	0.92	0.92	0.94	1.00	0.99	0.44	0.99	0.22	0.24	0.99	0.88	0.94	0.32	0.93
S₇	0.97	0.95	0.94	0.94	0.94	0.99	1.00	0.52	1.00	0.28	0.28	0.97	0.89	0.95	0.35	0.95
S₈	0.52	0.69	0.71	0.71	0.65	0.44	0.52	1.00	0.52	0.76	0.48	0.40	0.75	0.66	0.77	0.72
S₉	0.98	0.95	0.94	0.94	0.93	0.99	1.00	0.52	1.00	0.28	0.27	0.97	0.89	0.95	0.35	0.94
S₁₀	0.35	0.48	0.50	0.49	0.38	0.22	0.28	0.76	0.28	1.00	0.66	0.17	0.39	0.39	0.62	0.47
S₁₁	0.35	0.47	0.50	0.50	0.40	0.24	0.28	0.48	0.27	0.66	1.00	0.21	0.33	0.41	0.48	0.44
S₁₂	0.94	0.91	0.89	0.89	0.94	0.99	0.97	0.40	0.97	0.17	0.21	1.00	0.87	0.93	0.30	0.92
S₁₃	0.86	0.93	0.93	0.94	0.97	0.88	0.89	0.75	0.89	0.39	0.33	0.87	1.00	0.96	0.60	0.97
S₁₄	0.91	0.96	0.96	0.96	0.99	0.94	0.95	0.66	0.95	0.39	0.41	0.93	0.96	1.00	0.50	0.99
S₁₅	0.35	0.53	0.56	0.56	0.57	0.32	0.35	0.77	0.35	0.62	0.48	0.30	0.60	0.50	1.00	0.58

表 1 新疆一枝蒿不同极性提取物及洗脱物指纹图谱相似度 Tab.1 Similarities of the fingerprint of extracts and eluates with different polarities from A. rupestris

2.5 新疆一枝蒿不同极性提取物及洗脱物体外抗炎活性筛选^[10-11] 2.5.1 细胞处理

RAW264.7细胞于37 ℃、5% CO₂及饱和湿度环境下培养于含10%胎牛血清的1640培养基中，取对数生长期的细胞悬液，以180 μL(每孔3×10⁴个)接种于96孔培养板内，孵育18~24 h后进行后续实验。

2.5.2 细胞分组与加药

将RAW264.7细胞随机分组为正常对照组、脂多糖(LPS)对照组、空白对照组、筛选样品组，每孔分别加入S₁~S₁₅供试品溶液10 μL和LPS 10 μL，终体积达200 μL，设提取物浓度梯度为50、25、12.5、6.25 μg·mL^-1，样品与细胞共同孵育24 h进行以下检测。

2.5.3 指标测定

孵育24 h后，分别检测细胞活力和细胞上清液中NO、TNF-α、IL-6、IL-10和NF-κB水平，具体操作按照各自相应的试剂盒说明书进行。试验中先以细胞存活率和NO水平为指标，优选新疆一枝蒿不同极性提取物，优选出50%乙醇提取物及95%乙醇提取物抗炎效果良好，结果见表 2、3；再将2种抗炎效果良好的提取物进行不同溶剂洗脱，得到不同极性的洗脱物(S₆~S₁₅)；再以NO、TNF-α、IL-6、IL-10和NF-κB水平为指标筛选新疆一枝蒿抗炎有效部位，测定结果见表 3。

表 2 不同样品对细胞活力测定结果 Tab.2 Cell survival rates of different samples

样品(sample)	样品浓度(sample concentration)/ (μg·mL^-1)	细胞存活率(survival rate)/%
S₁	50	100
	25	100
	12.5	100
	6.25	100
S₂	50	99.5
	25	100
	12.5	100
	6.25	100
S₃	50	100
	25	100
	12.5	100
	6.25	100
S₄	50	100
	25	100
	12.5	100
	6.25	100
S₅	50	94.4
	25	100
	12.5	100
	6.25	100
S₆	50	100
	25	100
	12.5	100
	6.25	100
S₇	50	82.1
	25	100
	12.5	100
	6.25	100
对照组(control)	空白(blank)	100
LPS模型组(LPS model)	100


S₈	50	99.5
	25	100
	12.5	100
	6.25	100
S9	50	80.8
	25	100
	12.5	100
	6.25	100
S10	50	100
	25	100
	12.5	100
	6.25	100
S11	50	83.2
	25	100
	12.5	100
	6.25	100
S12	50	99.2
	25	100
	12.5	100
	6.25	100
S13	50	84.9
	25	100
	12.5	100
	6.25	100
S14	50	100
	25	100
	12.5	100
	6.25	100
S15	50
	25	100
	12.5	100
	6.25	100

表 2 不同样品对细胞活力测定结果 Tab.2 Cell survival rates of different samples

表 3 不同样品体外抗炎活性测定结果 Tab.3 Determination results of anti-inflammation activity in vitro of different samples

样品(sample)	C/ (μg·mL^-1)	NO/ (μg·mL^-1)	TNF-α/ (μg·mL^-1)	IL-6/ (pg·mL^-1)	IL-10/ (pg·mL^-1)	NF-κB/ (pg·mL^-1)
S₁	50	12.47±0.32	─	─	─	─
S₂	50	9.86±0.89	─	─	─	─
S₃	50	7.08±0.23	─	─	─	─
S₄	50	8.69±0.87	─	─	─	─
S₅	50	3.34±0.22	─	─	─	─
S₆	50	7.59±1.26	34.87±0.58	192.40±2.82	235.91±10.74	0.28±0.02
S₇	50	5.16±0.99	0.30±0.05	83.38±1.16	122.04±1.55	0.10±0.04
S₈	50	5.66±0.11	12.53±0.56	97.16±1.77	91.63±1.39	0.19±0.02
S₉	50	5.16±0.06	6.06±0.25	73.75±1.80	106.63±1.36	0.16±0.04
S₁₀	50	8.43±0.36	6.51±0.34	133.16±3.24	57.32±1.73	0.11±0.01
S₁₁	50	5.20±0.10	40.75±0.35	118.40±2.16	121.42±0.82	0.15±0.002
S₁₂	50	5.18±0.20	16.46±0.90	176.71±1.93	90.66±1.33	0.12±0.007
S₁₃	50	4.57±0.04	19.91±0.21	97.90±1.60	8.16±0.95	0.11±0.007
S₁₄	50	4.93±0.10	20.27±0.88	106.86±1.67	76.49±1.33	0.073±0.002
S₁₅	50	5.38±0.63	3.11±0.24	58.49±0.62	11.49±1.16	0.064±0.01
空白(blank)	0	2.49±0.11	0.28±0.09	52.10±1.63	20.81±0.55	0.074±0.002
LPS组(LPS group)	1	12.32±0.28	104.44±2.052	422.20±2.87	246.93±2.79	0.70±0.01
注(note):─.表示未进行检测(indicated it was not detected)

表 3 不同样品体外抗炎活性测定结果 Tab.3 Determination results of anti-inflammation activity in vitro of different samples

2.6 新疆一枝蒿不同极性提取物及洗脱物指纹图谱特征与其抗炎作用的灰色关联度分析^[12-16]

采用灰色关联度分析法对新疆一枝蒿不同极性提取物及洗脱物的指纹图谱特征峰与体外抗炎活性作用的相关性进行分析，根据关联度的大小，确定各成分对体外抗炎活性贡献的大小顺序，结果见表 4。

表 4 不同样品的指纹特征峰与体外抗炎活性的关联度测定 Tab.4 Correlation of anti-inflammation activity in vitro and fingerprint peaks of different samples

序号(NO.)	NF-κB		IL-6		IL-10		TNF-α
序号(NO.)	关联度(correlation degree)	关联序(correlation order)	关联度(correlation degree)	关联序(correlation order)	关联度(correlation degree)	关联序(correlation order)	关联度(correlation degree)	关联序(correlation order)
1	0.810	3	0.806	4	0.766	10	0.779	10
2	0.806	4	0.824	2	0.792	2	0.824	2
3	0.733	15	0.747	15	0.746	13	0.769	14
4	0.800	5	0.791	8	0.779	6	0.789	7
5	0.774	11	0.787	9	0.790	3	0.813	3
6	0.719	18	0.730	18	0.734	16	0.759	16
7	0.749	14	0.760	13	0.770	9	0.791	6
8	0.781	10	0.792	7	0.787	4	0.780	8
9	0.821	2	0.823	3	0.774	8	0.760	15
10	0.782	9	0.784	11	0.764	11	0.793	4
11(S)	0.907	1	0.925	1	0.888	1	0.850	1
12	0.768	13	0.759	14	0.753	12	0.737	18
13	0.726	16	0.742	16	0.729	18	0.774	12
14	0.792	6	0.804	5	0.784	5	0.780	9
15	0.773	12	0.763	12	0.743	14	0.753	17
16	0.722	17	0.736	17	0.730	17	0.771	13
17	0.791	7	0.785	10	0.739	15	0.776	11
18	0.783	8	0.796	6	0.776	7	0.791	5

表 4 不同样品的指纹特征峰与体外抗炎活性的关联度测定 Tab.4 Correlation of anti-inflammation activity in vitro and fingerprint peaks of different samples

根据关联度的大小，确定各成分对体外抗炎活性贡献的大小顺序。结果可知，新疆一枝蒿提取物、洗脱物是通过其内部“有效物质群”的协同作用达到体外抗炎的作用，其中样品S₇抗炎效果最佳。根据关联度的大小，确定各共有特征峰对NF-κB浓度作用贡献的大小顺序为:11 > 9 > 1 > 2 > 5 > 14 > 17 > 18 > 10 > 8 > 5 > 15 > 12 > 7 > 3 > 13 > 16 > 6；对肿瘤坏死因子TNF-α浓度作用贡献的大小顺序为:11 > 2 > 5 > 10 > 18 > 7 > 4 > 8 > 14 > 1 > 17 > 13 > 16 > 3 > 9 > 6 > 15 > 12；对炎症因子IL-6浓度作用贡献的大小顺序为:11 > 2 > 9 > 1 > 14 > 18 > 8 > 4 > 5 > 17 > 10 > 15 > 7 > 12 > 3 > 13 > 16 > 6；对炎症因子IL-10浓度作用贡献的大小顺序为:11 > 2 > 5 > 8 > 14 > 4 > 18 > 9 > 7 > 1 > 10 > 14 > 3 > 15 > 17 > 6 > 16 > 13。通过对照品比对及前期质谱分析实验结果比对^[5]，确定其中1为绿原酸，2为甲基槲皮素，5为金合欢素-己糖-葡萄糖醛酸，6为二羟基二甲氧基黄酮-己糖，7为高良姜素-3-己糖，8为金合欢素-7-O-芸香糖，9为蒙花苷，10为木犀草素，11为一枝蒿酮酸，12为山柰素，13为芹菜素，14为针叶春菊酸，15为紫花牡荆素，17峰为洋艾素，18为阿魏酸-4' -O-葡萄糖苷。

2.7 主要活性成分分析

分别取30%乙醇提取物(S₁)、50%乙醇提取物的30%乙醇洗脱物(S₇)、95%乙醇提取物的30%乙醇洗脱物(S₁₂)，以“2.3”项下确定的贡献度较大且有已知对照品的成分为指标，按“2.1”、“2.2”项下方法进行含量测定，结果见表 5。

表 5 不同样品含量测定(%) Tab.5 Results of content determination of different samples

结果3个不同部位的化合物，一枝蒿酮酸成分含量变化明显；S₁₂部位7个化合物的含量均明显变小；S₇部位中芹菜素、蔓荆子黄素、洋艾素含量变化较为明显。

3 讨论

中药谱效能够分析复杂中药体系中主要化学成分与药效的关系，能够反映中药内部各组分与药效间的相关性，指导和加速中药活性物质基础研究。灰色关联度分析来自灰色系统理论，是研究变量间相互关系的常用统计方法，是一种相对性的排序分析，根据序列曲线几何形状的相似程度来判断其联系是否紧密。一组几何曲线形状越相似，关联度越大，反之则越小，故可从所考察的复杂系统中找出主次因素，为系统综合决策及提高综合效益提供信息。灰色管亮度分析具有既包含已知信息又含有未知信息的特点，故非常适用于含有复杂化学成分的中药材的质量评价和控制^[17]。

本研究先通过细胞的活力测定和细胞上清液中NO的浓度，筛选出新疆一枝蒿体外抗炎最佳提取物为95%乙醇提取物，50%乙醇提取物次之。因此，后续选用这2种提取物进行聚酰胺层析分离，得到不同洗脱物，继而测定不同洗脱物的体外抗炎效果。本研究通过寻找“有效物质群”的指纹特征与体外抗炎作用之间的联系开展研究，在新疆一枝蒿不同极性提取物及洗脱物指纹图谱和药效研究的基础上，获得了18个特征峰峰面积和体外炎症因子TNF-α、IL-10、IL-6和NF-κB水平的量化数据。采用灰色关联度技术，确定了指纹图谱特征峰所代表的的化学成分对药效贡献的大小，继而根据贡献度的大小推测其体外抗炎作用。结果表明，指纹图谱中18个共有峰所代表的化学成分与体外抗炎活性的关联度均大于0.7，说明新疆一枝蒿的药效是多成分共同作用的结果。从分析结果发现，新疆一枝蒿中1、2、5、10、11、12、14、和18号峰对炎症因子水平的影响较大。主要活性成分研究结果表明，一枝蒿酮酸的含量可能与药效关系密切，在后续的实验中可以用该单体成分进一步验证。体外试验研究结果表明，样品S₇的抗炎活性最佳。体外试验与体内试验相比，有简单、方便、快速的优点，但从体外试验过渡到体内试验，仍然存在可变性，因此需要选用该样品进行后续的体内药效学验证。

本研究初步探索了新疆一枝蒿不同极性提取物及洗脱物指纹图谱与体外抗炎活性的关系，应用谱-效关系研究思路对新疆一枝蒿抗炎活性物质基础进行阐述，为研究其药效物质基础提供了科学依据，后期将研究关联度较大成分与体外抗炎活性药效的具体关系，确定药效较强组分的结构，为制定科学的质量评价标准提供参考。

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