2019, Vol. 39 
2. 孝感市妇幼保健院, 孝感 432000
2. Xiaogan Municipal Maternal and Child Health Care Hospital, Xiaogan 432000, China
糖尿病性心肌病变(diabeticcardiomyopathy，DCM)是糖尿病引起的常见慢性并发症之一，是一种心脏结构和功能异常并且独立于高血压、动脉粥样硬化心脏病和心脏瓣膜病及其他已知的心脏疾病的病变[1-3]。由于DCM的发病机制的复杂性，国内外学者认为胰岛素信号通路及自噬功能的改变在糖尿病引起的DCM过程中起到关键作用[4-6]。有研究表明，川芎嗪可以诱导自噬的发生[7-9]，本课题拟研究不同浓度及处理时间下，川芎嗪对心肌细胞H9c2的细胞活力影响；并探讨川芎嗪对高糖损伤H9c2胞内胰岛素信号通路和自噬功能的改善机制，为防治糖尿病心肌病病变提供新思路。
1 细胞系大鼠心肌H9c2(2-1)细胞株(冻存复苏，1×104·mL-1·支-1，批号GNR 5)购自于中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所；川芎嗪盐酸注射液(40 mg·支-1，批号20170841)购自合肥平光制药有限公司；细胞培养基DMEM(葡萄糖浓度5.5 mmol·L-1，批号SH30021)购自Hyclone公司；胰蛋白酶(Trypsin-EDTA，批号25200-056)、胎牛血清(FBS，批号1347575)购于Gibco公司；青链霉素双抗(批号BL505A)购自Biosharp公司；抗p-AMPK抗体(兔抗，CST，#2535)、抗AMPK抗体(兔抗，CST，#5831)、抗PI3K(兔抗，Abcam，ab40755)、p-Akt(兔抗，CST，#4060)、Akt(兔抗，CST，#9272)、mTOR(兔抗，CST，#2972)、p-mTOR(兔抗，CST，#2974)、β-actin(兔抗，谷歌，GB11001)等二抗购自武汉赛维尔生物科技有限公司；Compound C(ab120843)购于Abcam公司；葡萄糖试剂盒(F006)购自南京建成生物工程研究所。
2 实验方法 2.1 细胞培养及分组H9c2细胞培养于含有10%胎牛血清，抗生素(青霉素100 U·mL-1，链霉素100 U·mL-1)的DMEM培养基中，在37 ℃，5% CO2条件下培养，每1~2 d更换1次培养基。待细胞生长融合到50%~60%时，0.25%胰酶消化、传代培养。取对数生长期的细胞进行试验。实验分为7组:正常组；高糖组:40 mmol·L-1葡萄糖处理H9c2心肌细胞48 h；高糖+川芎嗪组:川芎嗪处理4 h后，吸出含药培养基，0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)洗2次，给予高糖处理48 h；高糖+雷帕霉素组:雷帕霉素预处理4 h后，吸出含药培养基，PBS洗2次，给予高糖处理48 h；高糖+胰岛素组:10 nmol·L-1胰岛素先处理1 h，吸出含药培养基，PBS洗2次，后给予高糖处理48 h；高糖+Compound C (一种AMPK抑制剂)组:1.25 μmol·L-1 Compound C先处理1 h，吸出含药培养基，PBS洗2次，后给予高糖处理48 h；高糖+Compound C +川芎嗪组:1.25 μmol·L-1 Compound C先处理1 h，吸出含药培养基，PBS洗2次，给予川芎嗪处理4 h后，按照上述操作方法再加入高糖处理48 h。
2.2 葡萄糖处理条件的选择将处于对数生长期的H9c2心肌细胞接种于96孔培养板中，接种密度为4×104，待心肌细胞生长到培养孔面积50%~60%时，按照基础培养基含糖量(5.5 mmol·L-1)，依次加入不同浓度的葡萄糖(10、20、30、40、50 mmol·L-1)处理48 h，每组设置10个复孔。同时，在高糖浓度为40 mmol·L-1条件下，设置不同处理时间(0、12、24、36、48、60 h)，按照上述处理方法，最后每孔加入10 μL CCK-8试剂(即用型)，轻摇，37 ℃孵育2 h，用酶标仪(λ=450 nm)记录各孔的吸收度A。按处理组A值/对照组A值×100%计算细胞活力，重复3次。
2.3 川芎嗪剂量依赖性和时间依赖性试验使用川芎嗪给药处理后，采用p-AMPK/AMPK的蛋白表达作为川芎嗪给药剂量和给药时间的评价依据，分别配制不同浓度的川芎嗪(0、0.025、0.05、0.075、0.1 mmol·L-1)处理H9c2心肌细胞4 h及使用0.1 mmol·L-1川芎嗪处理H9c2心肌细胞不同时间点(0、2、3、4、5 h)后，再给予高糖刺激48 h，收集H9c2细胞裂解液行Western Blot实验，以此来选择川芎嗪的处理时间和浓度。
2.4 葡萄糖消耗试验按照“2.1”项细胞分组方法，依次加入各实验组的不同处理因素进行试验，高糖处理48 h，随后吸出50 µL上清液用于测定葡萄糖含量，加入等体积培养基。最后每孔加入10 μL CCK-8试剂(即用型)，同上实验并计算细胞活力。
2.5 Western-blot检测蛋白表达提前备好配胶所需的各类试剂，其中包含30 %丙烯酰胺、pH=6.8或8.8的Tris-HCl、10% AP(过硫酸铵)、100%四甲基乙二胺(TEMED)以及超纯水，干净的大小制胶玻璃板，制胶梳齿和相关物件，从4 ℃冰箱拿出，常温放置20~30 min，准备制胶。按要求配制好相应浓度的SDS-PAGE胶。H9c2心肌细胞接种于中型培养皿中，培养至50%~60%密度时，按照上述分组情况分别给予不同的处理因素，然后用预冷的PBS(加入磷酸酶和蛋白酶抑制剂)洗2次，加入强裂解液100 µL，4 ℃静置30 min，用细胞刮刀依次收集裂解液。放入1.5 mL的EP(eppendorf)管中，12 000 r·min-1离心15 min，取上清，采用二辛酸(bicinchoninic acid，BCA)法进行蛋白定量。配制SDS-PAGE分离胶，在80 V电压条件下跑胶，待蛋白跑到分离胶下缘时(约1.5 h)，停止跑胶，小心地从制胶板中取出分离胶放入电泳液中待用。取分离胶大小的PVDF膜，先在甲醇溶液中活化10 min，再放到电泳液中平衡，最后采用三明治法小心贴合胶和膜，避免有气泡，最后放入转膜槽中，采用湿法250 mA恒流转膜100 min。用5%脱脂奶粉封闭60 min后以一抗4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗3次，每次10 min，加入对应二抗，室温孵育1 h，同样的，TBST洗3次，每次10 min。最后，在Bio-Rad的显影仪上用发光试剂ECL显色曝光，凝胶成像系统扫描分析结果，Image J统计灰度值。
2.6 统计学方法数据用X±SEM表示，组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)，然后进行Turkey检验，P < 0.05显示具有统计学意义。
3 结果 3.1 高糖对心肌细胞活力的影响采用CCK8法检测细胞活力，测定结果表明，以正常对照组(即5.5 mmol·L-1葡萄糖培养)细胞存活率为100%作为参照，高糖可致心肌细胞活力随着高糖浓度以及刺激时间延长而逐渐降低，心肌细胞在处理糖浓度高于40 mmol·L-1以上，处理时间超过48 h后，细胞活力才开始出现明显下降，且与正常对照组比较，具有统计学意义(P < 0. 05)。如图 1所示。
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(与5.5 mmol·L-1葡萄糖处理0 h比较，*P < 0.05，**P < 0.01) (compared with treatment of 5.5 mmol·L-1 glucose for 0 h, *P < 0.05, **P < 0.01) 图 1 不同处理浓度(A)和时间(B)的葡萄糖对心肌细胞H9c2的细胞存活率影响 Fig.1 Effects of different concentration(A) and treatment time(B) of glucose on cell viability of H9c2 cells |
为进一步在高糖处理条件下，确定川芎嗪的预处理浓度和时间，本实验分别对川芎嗪设置0、0.025、0.05、0.075、0.1 mmol·L-1等系列浓度，探讨川芎嗪激活p-AMPK的最佳浓度点和时间点。结果如图 2所示，很明显，高糖处理条件下，川芎嗪浓度在0.075 mmol·L-1以上时，p-AMPK表达显著增加，故采用0.1 mmol·L-1作为川芎嗪的药物处理浓度。接着，同时采用时间依赖性(设置川芎嗪预处理时间为0、2、3、4、5 h)检测川芎嗪激活p-AMPK的最佳时间点。当处理时间为4 h以上，p-AMPK表达明显增加。
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图 2 不同浓度和处理时间的川芎嗪对H9c2细胞的AMPK蛋白表达的影响(与正常组比较，**P < 0.01；与高糖组比较，#P < 0.05) Fig.2 Effects of different concentration(A) and treatment time(B) of tetramethylpyrazine on AMPK expressions of H9c2 cells (compared with control group, ** P < 0.01;compared with high glocise group, #P < 0.05) |
同时，结合40 mmol·L-1葡萄糖处理H9c2心肌细胞48 h可引起明显的细胞活力下降，使细胞活力降低至64.30%±0.27% (P < 0.05)，本实验采用40 mmol·L-1葡萄糖处理H9c2心肌细胞48 h作为建模条件，然后给予0.1 mmol·L-1川芎嗪作为药物的处理浓度，处理时间为4 h，探讨川芎嗪介导AMPK信号通路改善H9c2心肌细胞应对高浓度葡萄糖的影响。
3.3 川穹嗪改善高糖引起的胰岛素抵抗高糖诱导胰岛素抵抗的发生在很多文章中都有报道[10]，本实验检测川芎嗪对此的改善作用，结果如图 3所示。40 mmol·L-1葡萄糖处理H9c2心肌细胞48 h可显著降低PI3K及p-Akt的蛋白表达水平，给予川芎嗪后明显得到改善；同时，在高糖处理条件下，给予胰岛素通路激活剂，胰岛素也可以明显改善损伤的PI3K/Akt信号通路。
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Ⅰ.正常(normal) Ⅱ.高糖(high glucose) Ⅲ.川芎嗪(tetramethylpyrazine) Ⅳ.胰岛素(insulin) 图 3 川芎嗪和胰岛素对高糖环境下H9c2细胞的PI3K/Akt信号通路的影响(与正常组比较，**P < 0.01；与高糖组比较，#P < 0.05) Fig.3 The effects of tetramethylpyrazine and insulin on PI3K/Akt signaling pathway in high glucose-treated H9c2 cells (compared with control group, **P < 0.01;compared with high glucose group, #P < 0.05) |
同时，检测上清液中的葡萄糖的水平，以及采用96孔板检测细胞活力的改变，结果如图 4所示。
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Ⅰ.正常(normal) Ⅱ.高糖(high glucose) Ⅲ.川芎嗪(tetramethylpyrazine)Ⅳ.胰岛素(insulin) 图 4 川芎嗪和insulin对高糖环境下H9c2细胞培养上清液中葡萄糖水平(A)和细胞活力(B)的影响(与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与高糖组比较，#P < 0.05) Fig.4 The effects of tetramethylpyrazine and insulin on glucose content (A) and cell viability (B) in high glucose-treated H9c2 cells (compared with control group, *P < 0.05, **P < 0.01;compard with high glucose group, #P < 0.05) |
可见，随着药物川芎嗪的孵育，下调的胰岛素信号通路关键分子PI3K/p-Akt表达增加(图 3)，降低的葡萄糖消耗，葡萄糖/CCK8的比值明显回升(图 4)，其作用与胰岛素通路激动剂胰岛素类似。说明川芎嗪可能激活胰岛素信号通路，改善胰岛素抵抗，增加细胞对葡萄糖的利用。
3.4 川芎嗪激活AMPK活化PI3K为了探讨在高糖处理的H9c2心肌细胞中AMPK参与活化Pi3K的分子机制，提前孵育AMPK抑制剂Compound C(CC，1.25 μmol·L-1)1 h，再给予40 mmol·L-1葡萄糖处理或进一步加入川芎嗪，检测PI3K的蛋白表达水平，结果如图 5所示。
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Ⅰ.正常(normal) Ⅱ.高糖(high glucose) Ⅲ.川芎嗪(tetramethylpyrazine)Ⅳ. CC Ⅴ. CC+川芎嗪(tetramethylpyrazine) 图 5 川芎嗪通过AMPK激活PI3K(与正常组比较，**P < 0.01；与高糖组比较，#P < 0.05；与高糖加Compound C组比较，@P < 0.05) Fig.5 Tetramethylpyrazine activates PI3K by activating AMPK (compared with control group, **P < 0.01;compared with high glucose group, #P < 0.05;compared with high glucose plus Compound C group, @P < 0.05) |
由结果可知，与正常组比较，下调的PI3K被川芎嗪有效抑制。在加入AMPK抑制剂Compound C处理的高糖条件下，PI3K抑制更明显；给予川芎嗪处理后，可以部分缓解下调的PI3K，说明川芎嗪还可能通过其他信号通路共同激活调控PI3K。
3.5 川穹嗪对高糖环境下雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的影响多篇文献显示，高糖可引起mTOR(自噬抑制子)激活，导致自噬通路的失活，抑制细胞内的蛋白质清除系统，增加细胞毒性的发生[11]。检测高糖诱导mTOR的激活情况和川芎嗪的保护作用下的结果如图 6所示。40 mmol·L-1葡萄糖处理H9c2心肌细胞48 h可显著增加磷酸化p-mTOR ser2481的蛋白表达水平。给予川芎嗪后p-mTOR蛋白表达增加的情况明显得到改善，并且给予mTOR的抑制剂雷帕霉素也可以得到相似结果。
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Ⅰ.正常(normal) Ⅱ.高糖(high glucose) Ⅲ.川芎嗪
图 6 川芎嗪和雷帕霉素对高糖环境下H9c2细胞中mTOR的影响(tetramethylpyrazine)Ⅳ.雷帕霉素(rapamycin) (与正常组比较，**P < 0.01；与高糖组比较，#P < 0.05，#P < 0.01) Fig.6 The effects of tetramethylpyrazine and rapamycin on mTOR expressions in high glucose-treated H9c2 cells (compared wth control group, **P < 0.01;compardd with high glucose group versus, #P < 0.05, ##P < 0.01) |
心肌细胞凋亡在糖尿病心肌病发生与进展的过程中发挥重要作用。现已证实，胰岛素抵抗和自噬参与到糖尿病心肌病的进程中。然而，已有许多文献报道，在高糖诱导损伤的心肌细胞中，AMPK活性的丢失将导致细胞活力明显下降[12-13]。故而得出1个假设，AMPK在调控胰岛素信号通路和自噬通路中扮演着关键作用。基于此，本研究通过在体外细胞模型中建立高糖诱导H9c2心肌细胞损伤模型，探讨其中的可能分子机制，以及采用传统中药单体化合物川芎嗪进行治疗，评价其疗效。
大量文献报道，胞内能量感受器AMPK在糖尿病心肌病中起到举足轻重的作用，可以通过糖脂代谢的一些关键步骤激活AMPK，促使ATP合成增加。有意思的是，在肥胖的啮齿类动物心脏中，PP2C的上调和心脏的脂毒性可能引起AMPK的失活，在糖尿病和体外细胞模型中，大量研究均表明AMPK处于失活状态[14]。另外，不管是体外细胞还是体内动物模型，胰岛素抵抗的发生也加剧了糖尿病心肌病的进程[15]。这和细胞模型结果相似。
有文献报道[16]，激活的AMPK是可以导致胰岛素信号通路中PI3K的活化，而激活的PI3K具有磷脂酰肌醇激酶的活性，是一种丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶，进而激活Akt的Ser 437位点，导致Akt激活。在试验中，给予川芎嗪处理后，AMPK的活性明显增加；而PI3K/Akt激酶的活性也明显得到恢复，同时，降低的葡萄糖消耗及葡萄糖/CCK8值明显增加，这和给予胰岛素通路激动剂胰岛素的作用相当。表明胰岛素抵抗得到改善，心肌细胞对葡萄糖的利用增加。
另外，在心肌细胞出现损伤过程中，细胞自噬的发生对于维持胞内稳态环境至关重要。AMPK的活化势必引起mTOR抑制子TSC磷酸化激活，而TSC复合物是一种GTP酶激活蛋白，它与小G蛋白Rag连在一起向Rheb靠拢。由于Rheb的GTP形式是mTOR的活化形式，但是，其可以被AMPK活化的TSC复合物(主要是小G蛋白)转换成GDP-Rheb形式，最后使mTOR失活[17]。相反，如果AMPK失活，mTOR必定活化。于是检测自噬抑制子mTOR的改变，发现高糖情况下，p-mTOR ser 2481的蛋白水平明显增加。在给予川芎嗪和mTOR选择性抑制剂雷帕霉素处理后，显著抑制。说明川芎嗪对于激活细胞自噬反应，具有明显改善胞内蛋白稳态的功能。而文献报道PI3K/AKT是TSC激活的显著上游分子[18]sup>。基于此，推测AMPK/PI3K/mTOR信号通路参与了川芎嗪调控高糖损伤H9c2细胞的过程。
综上所述，川芎嗪通过激活AMPK信号通路，一方面活化胰岛素信号通路，另一方面调控细胞自噬的发生，最终达到改善高糖诱导心肌细胞损伤的功能。
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