2. 江西中医药大学, 南昌 330004
2. Jiangxi University of Traditional Chineses Medicine, Nanchang 330004, China
罗丹明123(Rho 123)是罗丹明系列染料中的1种,因其分子结构呈刚性平面状且具有较高的荧光量子产率,故荧光较强,是一种常见的荧光探针物质[1-2]。Rho 123是P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的经典底物,能够透过细胞膜,选择性地染色活细胞线粒体,因此Rho 123可广泛作用于P-gp功能及活性评价[3]、线粒体膜电位[4]、细胞凋亡[5]以及口服药物的吸收和分泌影响[6-7]。目前,国内外检测Rho 123主要采用流式细胞仪检测法[8]、荧光分光光度检测法[9]、HPLC法[10]、LC-MS法[11]、LC-MS/MS法[12]、微板读数器法[13]等,费用较高且均存在灵敏度低、操作烦琐费时等缺点。本研究旨在建立一种灵敏度高特异性强,样品处理简便的HPLC-荧光检测法,测定细胞悬液中Rho 123的蓄积,从而满足迅速测定对P-gp功能及活性评价、线粒体膜电位、细胞凋亡以及口服药物的吸收和分泌影响等研究的需要,为药代动力学、药物相互作用、肿瘤的发生以及多药耐药等的研究提供理论依据[12]。
欧前胡素是来源于白芷、独活、当归等中药种的1种呋喃型香豆素成分,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性[13-14],课题组研究发现,欧前胡素可抑制P-gp介导如紫杉醇、硫酸长春新碱肿瘤药物外排,增加紫杉醇等药物的肠道转运及生物利用度[15-16]。Rho 123是P-gp底物,细胞悬液中Rho 123含量可反映P-gp的外排及筛选抑制P-gp功能的成分。因此,本文拟通过对P-gp底物Rho 123含量的测定,探讨欧前胡素增加紫杉醇等药物的肠道转运是否与抑制P-gp外排功能有关。
1 实验材料与仪器 1.1 细胞人卵巢癌细胞株(A2780)、人卵巢癌耐紫杉醇细胞株(A2780/ Taxol)及人白血病细胞株K562、人白血病耐阿霉素细胞株K562/ADR均购于上海歌凡生物科技有限公司。
1.2 试剂Rho 123对照品(Sigma公司,批号1012320000);对照品欧前胡素(批号110826-200712)、盐酸维拉帕米(批号100223-200102),中国食品药品检定研究院;考马斯亮蓝G-250(碧云天生物科技研究所);细胞裂解液(Solarbio,北京索莱宝科技有限公司);牛血清白蛋白(Solarbio,北京索莱宝科技有限公司);RPMI1640培养基(Hyclone,赛默飞世尔生物化学制品);胎牛血清(Gibco,赛默飞世尔生物化学制品);青霉素-链霉素(Solarbio,北京索莱宝科技有限公司);0.25%EDTA-胰蛋白酶(Gibco,赛默飞世尔生物化学制品);Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS)(without Magnesium with Calcium,Solarbio,北京索莱宝科技有限公司);乙腈(色谱纯,TEDIA公司);三乙胺(分析纯,南京化学试剂有限公司);磷酸(分析纯,上海化学试剂有限公司)。
1.3 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪与Agilent 1200荧光检测器,安捷伦科技有限公司;PHS-3C型pH计,上海精密科学仪器公司;多功能酶标仪(Tecan,Spark 10M);高速冷冻离心机(Sigma公司);BS124S型电子分析天平(Sartorius公司)。
2 实验方法与结果 2.1 HPLC-FLD测定肿瘤细胞中Rho 123含量方法的建立 2.1.1 检测条件色谱柱:Phenomenex-C18柱(5 μm,250 mm×4.6 mm);流动相:乙腈-1%三乙胺(磷酸调pH=3.0)(28:72),流速:1 mL·min-1;柱温:40 ℃;进样量:20 μL;FLD条件:激发波长485 nm,发射波长546 nm。
2.1.2 对照品溶液的制备精密称取Rho 123对照品6.0 mg至25 mL棕色量瓶中,用乙腈定容,摇匀后即得质量浓度为240 μg·mL-1的Rho 123对照品储备液。采用逐级稀释法分别加入乙腈稀释Rho 123储备液,配制成质量浓度分别为30、15、7.5、3.75、1.875、0.937 5、0.468 8 μg·mL-1的一系列对照品溶液,置4 ℃保存。
2.1.3 样品处理 2.1.3.1 A2780与A2780/Taxol细胞培养A2780与A2780/Taxol细胞培养在含10%的胎牛血清和100 U·mL-1青霉素、链霉素的RPMI1640培养基中,1×106个·mL-1接种于6孔板中,待细胞在板中生长融合至70%~80%,弃去完全培养基,用冰冷的Hank,s平衡盐溶液(HBSS)清洗2次,加入HBSS 500 μL,用细胞刮轻轻将细胞刮下,置于1.5 mL的EP管中,冻存于-80℃冰箱中以破碎细胞。反复冻融3次后,12 000 r·min-1离心10 min,取上清液。
A2780/ Taxol细胞株用含终质量浓度为100 0 ng·mL-1 Taxol的完全培养基维持其耐药性,实验前无药培养2周。
2.1.3.2 K562与K562/ADR细胞培养K562与K562/ADR细胞培养在含10%的胎牛血清和100 U·mL-1青霉素、链霉素的RPMI1640培养基中,余下操作同“2.1.3.1”项下。
K562/ADR细胞株用含终质量浓度为1 000 ng·mL-1ADR的完全培养基维持其耐药性,实验前无药培养2周。
2.1.3.3 标准曲线及质控细胞悬液样品的处理取空白的细胞裂解液180 μL,置于1.5 mL的EP管中,加入相应质量浓度的Rho 123对照品溶液20 μL,再与300 μL的乙腈混匀,涡旋3 min,140 00 r·min-1离心20 min后取上清液,将250 μL上清液与500 μL的流动相混匀,涡旋3 min,以0.22 μm的微孔滤膜过滤,用于HPLC分析。
2.1.3.4 待测细胞悬液样品的处理取待测的肿瘤细胞的裂解液200 μL与300 μL的乙腈混匀,涡旋3 min,14 000 r·min-1离心20 min后取上清液,将250 μL上清液与500 μL流动相混匀,涡旋3 min,以0.22 μm的微孔滤膜过滤,用于HPLC分析。
2.1.4 方法学考察本文考察了4种细胞的方法学,分别为K562、K562/ADR、A2780、A2780/Taxol,结果表明各细胞间无显著差异,因此,本文仅附K562/ADR细胞的方法学研究结果。
2.1.4.1 专属性分别将3份不同来源的空白细胞裂解液、Rho 123细胞对照品标准液、给予Rho 123细胞裂解液样品,按“2.1.3”项下方法处理并进行HPLC分析。在上述色谱条件下,测得空白细胞组溶液、对照品溶液、细胞样品溶液的色谱图,如图 1所示:分析物Rho 123有较大的色谱峰,不受杂峰的干扰,基线噪音小,方法专属性良好,保留时间约为9.92 min,具有良好的特异性和分离度。
细胞悬液中Rho123在质量浓度为3.516 ~600 ng·mL-1内线性关系良好,得到的标准曲线:
Y=1.199 3X-4.003 6 R2=0.999 7
采用逐级稀释法,检测到Rho 123的定量下限为1.172 ng·mL-1(S/N=10.1),检测下限0.367 ng·mL-1(S/N=3.1)。
2.1.4.3 精密度试验连续3 d用空白细胞液配制低、中、高质控样品即含Rho123质量浓度为3.516、75、600 ng·mL-1系列浓度标准样品各6份,进行处理并分析,计算其浓度,考察日间和日内精密度。质控样品与标准曲线同批测定,通过随行标准曲线来计算质控样品的浓度。日内平行测定6次,计算日内精密度;每日测定1次,连续3 d,计算日间精密度。结果Rho 123的日内精密度为1.4%~4.9%,日间精密度为2.8%~7.4%,小于10%,重复性好,符合要求。
2.1.4.4 回收率试验用空白细胞液配制含Rho 123低、中、高的质控样品各6份,然后用乙腈配制与Rho 123低、中、高质控相等浓度的对照质控样品各6份,进行处理,各取20 μL进行HPLC检测,记录色谱图。结果见表 1。
用空白细胞液配制含Rho123低、中、高的质控样品各3份,分别测定样品在室温条件下放置24 h、-80 ℃储存15 d以及3次冷冻-解冻循环后的稳定性(每次在-80 ℃冰箱中放置12 h)。结果见表 2。表明样品稳定性均良好。
按“2.1.3”项下方法培养各细胞,并接种于6孔细胞培养板中,过夜后,分别给予不同浓度的药物溶液或HBSS,置于37 ℃,5% CO2细胞培养箱中孵育,60 min后置于冰上终止反应(约10 min),1 000 r·min-1,4 ℃条件下离心5 min,弃去上清液,加入冰冷的HBSS清洗2次。每孔加入含5 μg·mL-1 Rho 123的HBSS液1 mL,置于37 ℃,5% CO2细胞培养箱中孵育60 min,结束后,置于冰上终止反应(约10 min),弃去上清液,加入冰冷的HBSS清洗2次。加入HBSS 500 μL并用细胞刮轻轻地将细胞刮下来,置于1.5 mL EP管中,冻存于-80 ℃冰箱中以破碎细胞。反复冻融3次,12 000 r·min-1离心10 min后取上清液。按照“2.1.3”项下的处理方法处理样品,同时取适量的细胞悬液按照Bradford蛋白浓度测定方法进行蛋白定量。将每管细胞内的Rho 123浓度与相应每管的总蛋白含量相除,用以消除每管细胞数量所带来的误差。实验分组及加样顺序见表 3。欧前胡素对不同肿瘤细胞中Rho 123含量的影响结果见表 4、5。
A2780/ Taxol与A2780相比,细胞内Rho123含量明显降低,表明A2780/ Taxol耐药性形成,A2780/Taxol细胞株的P-gp的高表达将进入细胞内的Rho123更多地排出细胞外。在欧前胡素的作用下,Rho123在A2780/ Taxol细胞内的蓄积情况出现改变,表现为随着欧前胡素浓度的增加,Rho 123的蓄积逐渐增加,外排逐渐减少。2、5、10 μg·mL-1欧前胡素组的A2780/ Taxol细胞内的蓄积倍数分别为2.79、3.53、4.18,且各组与A2780/ Taxol阴性对照组相比具有统计学意义(P < 0.05),提示欧前胡素具有增加A2780/ Taxol细胞内Rho 123蓄积的作用,且与欧前胡素的浓度相关,但作用能力稍低于维拉帕米。
K562/ADR与K562相比,细胞内Rho 123含量明显降低,表明K562/ADR耐药性形成,K562/ADR细胞株的P-gp的高表达将进入细胞内的Rho 123更多地排出细胞外。在欧前胡素的作用下,Rho 123在K562/ADR细胞内的蓄积情况出现明显变化,随着欧前胡素浓度的增加,Rho 123的蓄积逐渐增加,外排逐渐减少。2、5、10 μg·mL-1欧前胡素组的K562/ADR细胞内的蓄积倍数分别为2.18、2.36、2.39,且各组与K562/ADR阴性对照组相比具有统计学意义(P < 0.05),提示欧前胡素具有增加K562/ADR细胞内Rho 123蓄积的作用和抑制P-gp外排的作用,且与欧前胡素的浓度相关。
3 讨论本研究采用HPLC-荧光检测法测定细胞悬液中Rho 123的蓄积,解决了流式细胞仪检测法费用昂贵,荧光分光光度法灵敏度低、数据偏差较大、重现性差, LC-MS与LC-MS/MS法操作烦琐的问题,可在大多数实验室普及。
根据Rho 123分子结构呈刚性平面状且具有较高的荧光量子产率,可使其荧光较强[1-2],采用HPLC-荧光检测器测定Rho 123在细胞内的蓄积影响,能够消除HPLC灵敏度有限的劣势,且该检测器较为普及,具有较高的实用价值。目前,常用的蛋白沉淀剂有甲醇、乙腈、乙酸乙酯以及三氯甲烷。本实验通过考察甲醇、乙腈对细胞裂解液混合条件下Rho 123提取回收率的影响,结果表明使用乙腈沉淀蛋白的能力较甲醇更高,回收率在96.4%以上,符合样本的测定要求。本方法成功用于研究细胞内Rho 123的蓄积影响,表现为随着欧前胡素浓度的增加,Rho 123的蓄积逐渐增加,外排逐渐减少,故本方法能够满足对P-gp功能及活性评价、线粒体膜电位、细胞凋亡以及口服药物的吸收和分泌影响等研究的需要,为药代动力学、药物相互作用、肿瘤的发生以及多药耐药等的研究提供理论依据。
化学治疗在恶性肿瘤的综合治疗中占有非常重要的地位,与手术治疗、放射治疗一起,成为恶性肿瘤治疗的3把利剑,但临床上肿瘤的多药耐药(multidrug resistance,MDR)对疗效的影响十分严重,通过跨膜转运蛋白的外排泵作用,可以降低多药耐药。P-gp是重要的外排转运蛋白,许多一线临床广泛使用的药物均受其影响,导致肿瘤的多药耐药的发生,如多柔比星、紫杉烷类、长春花生物碱类等。近年来研究发现,中药活性成分在逆转多药耐药方面具有很好的疗效,以中药为研究对象,筛选P-gp逆转剂引起了研究者的广泛重视。结合前期研究结果及本次实验发现,欧前胡素具有抑制P-gp外排药物的功能,其作用机理尚需进一步深入研究。
[1] |
ANNAERT P, BROUWER KLR. Assessment of drug interactions in hepatobiliary transport using rhodamine 123 in sandwich-cultured rat hepatocytes[J]. Drug Metab Dispos, 2005, 33(3): 388. DOI:10.1124/dmd.104.001669 |
[2] |
TANG FX, HUI OY. Bidirectional transport of rhodamine 123 and Hoechst 333342 fluorescence probes of the binding sites on P-glycoprotein across MDCK-MDR1 cell monolayers[J]. J Pharm Sci, 2004, 93(5): 1185. DOI:10.1002/jps.20046 |
[3] |
张圣村, 马敏, 徐丽丽. 阿帕替尼逆转P-gp转运体介导的乳腺癌化疗多药耐药性的作用及其机制[J]. 肿瘤防治研究, 2018, 45(4): 210. ZHANG SC, MA M, XU LL. Reversal effect of apatinib on P-gp-mediated multidrug resistance of human breast cancer and its mechanisms[J]. Cancer Res Prev Treat, 2018, 45(4): 210. DOI:10.3971/j.issn.1000-8578.2018.17.1112 |
[4] |
毕星宇, 张栋栋, 朱鹏飞, 等. 体外操作对人卵母细胞线粒体膜电位影响的研究[J]. 中华生殖与避孕杂志, 2017, 37(5): 389. BI XY, ZHANG DD, ZHU PF, et al. Effect of in vitro manipulation on mitochondrial membrane potential of human oocytes[J]. Chin J Reprod Contracep, 2017, 37(5): 389. |
[5] |
任改艳, 孙阿宁, 张晶晶, 等. NF-κB在细胞凋亡中调节作用的研究进展[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 2015, 29(2): 323. REN GY, SUN AN, ZHANG JJ, et al. Advances in roles of NF-κB in regulating pathways of apoptosis[J]. Chin J Pharmacol Toxicol, 2015, 29(2): 323. DOI:10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.26 |
[6] |
LIN Y, KATSUMI H. Effects of labrasol and other pharmaceutical excipients on the intestinal transport and absorp tion of rhodamine 123 a P-glycop rotein substrate in rats[J]. Biol Pharm Bull, 2007, 30(7): 1301. DOI:10.1248/bpb.30.1301 |
[7] |
SHEN Q, LIN YL, HANDA T, et al. Modulation of intestinal P-glycoprotein fun ction by polyethylene g lycols and their derivatives by in vitro transport and in situ absorption studies[J]. Int J Pharm, 2006, 313(1-2): 49. DOI:10.1016/j.ijpharm.2006.01.020 |
[8] |
周勇, 钟文彬, 陈凯, 等. Disulfiram联合Cu通过上调TNF-α表达及蓄积ROS诱导白血病干细胞凋亡[J]. 第三军医大学学报, 2015, 37(10): 984. ZHOU Y, ZHONG WB, CHEN K, et al. Disulfram combined with copper induces leukemia stem cell apoptosis through TNF-α/ROS pathway[J]. Acta Acad Med Mil Tert, 2015, 37(10): 984. |
[9] |
FONTAINE M, ELMQUST WF, MILLER DW. Use of rhodamine123 to examine the functional activity of P-glycoprotein in primary cultured brain microvessel endothelial cell monolayers[J]. Life Sci, 1996, 59(18): 1521. DOI:10.1016/0024-3205(96)00483-3 |
[10] |
唐霞, 辛华雯, 欧阳萌, 等. 高效液相色谱法测定大鼠血浆罗丹明123的浓度[J]. 医药导报, 2017, 36(9): 971. TANG X, XIN HW, OUYANG M, et al. Determination of Rhodamine 123 in rat plasma by high performance liquid chromatography[J]. Her Med, 2017, 36(9): 971. |
[11] |
SMALLEY J, KADIYALA P, XIN B, et al. Development of an on-line extraction turbulent flow chromatography tandem mass spectrometry method for cassette analysis of Caco 2 cell based bi-directional assay samples[J]. J Chromatogr B, 2006, 830(2): 270. |
[12] |
常媛媛, 魏静瑶, 魏涵, 等. LC-MS/MS法测定细胞悬液中罗丹明123的浓度[J]. 中国临床药理学杂志, 2018, 34(8): 979. CHANG YY, WEI JY, WEI H, et al. Determination of rhodamine 123 in cell culture system by LC-MS/MS[J]. Chin J Clin Pharmacol, 2018, 34(8): 979. |
[13] |
CHOOCHUAY K, CHUNHACHA P, PONGRAKHANANON V, et al. Imperatorin sensitizes anoikis and inhibits anchorage-independent growth of lung cancer cells[J]. J Nat Med, 2013, 67(3): 599. DOI:10.1007/s11418-012-0719-y |
[14] |
黄志平, 邵立龙, 阮阳平. 欧前胡素对顺铂的骨肉瘤细胞抗肿瘤作用的增效作用[J]. 中国现代应用药学, 2015, 32(10): 1193. HUANG ZP, SHAO LL, RUAN YP. Anti-tumor effect and mechanism of imperatorin enhances the cytotoxicity of cisplatin osteosarcoma cells[J]. Chin J Mod Appl Pharm, 2015, 32(10): 1193. |
[15] |
管雪静, 余世平, 梁新丽, 等. 白芷中10种呋喃型香豆素对长春新碱肠道转运的影响[J]. 中草药, 2015, 46(14): 2117. GUAN XJ, YU SP, LIANG XL, et al. Effect of 10 furanocoumarins in Angelica dahurica on intestinal transport of vincristine[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2015, 46(14): 2117. DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2015.14.017 |
[16] |
管咏梅, 朱卫丰, 梁新丽, 等. LC-MS研究白芷中香豆素成分对多烯紫杉醇药代动力学的影响[J]. 中国中药杂志, 2017, 42(24): 4870. GUAN YM, ZHU WF, LIANG XL, et al. Effect investigation of coumarin constituents in Angelica dahurica on pharmacokinetics of docetaxel by LC-MS[J]. China J Chin Mater Med, 2017, 42(24): 4870. |
[17] |
DORABABU M, NISHIMURA A, PRABHA T, et al. Effect of cyclosporine on drug transport and pharmacokinetics of nifedipine[J]. Biomed Pharmacother, 2009, 63(9): 697. DOI:10.1016/j.biopha.2009.04.031 |