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  药物分析杂志   2019, Vol. 39 Issue (9): 1567-1573.  DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.09.04
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生物检定·活性分析

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李志勇, 汪春燕, 汤涛, 梁新丽, 祝婧云. HPLC-FLD法测定欧前胡素对肿瘤耐药细胞悬液中罗丹明123含量的影响[J]. 药物分析杂志, 2019, 39(9): 1567-1573. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.09.04.
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LI Zhi-yong, WANG Chun-yan, TANG Tao, LIANG Xin-li, ZHU Jing-yun. Effect of imperatorin on the content of Rho 123 in the drug-resistant cell suspension of tumor by HPLC-FLD[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2019, 39(9): 1567-1573. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.09.04.
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基金项目

江西省自然科学基金项目(20161ACB21020)

第一作者

李志勇, 13677085959;E-mail:11058579@qq.com

通信作者

祝婧云, 13576922043;E-mail:271174521@qq.com

文章历史

收稿日期:2018-09-06
HPLC-FLD法测定欧前胡素对肿瘤耐药细胞悬液中罗丹明123含量的影响
李志勇 1, 汪春燕 2, 汤涛 2, 梁新丽 2, 祝婧云 1    
1. 南昌大学 第四附属医院药学部, 南昌 330003;
2. 江西中医药大学, 南昌 330004
摘要目的:建立高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)测定肿瘤耐药细胞中罗丹明123(Rho 123)的浓度,并采用建立的检测方法考察欧前胡素对Rho 123含量的影响。方法:用乙腈沉淀法进行蛋白沉淀。色谱柱为Phenomenex-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱温为40℃,流动相为乙腈-1%三乙胺(磷酸调至pH为3.0)(28:72),流速为1 mL·min-1,激发波长485 nm,发射波长546 nm,进样量为20 μL。结果:Rho 123标准曲线为Y=1.199 3X-4.003 6(R2=0.999 7),其质量浓度在9.375~600 ng·mL-1范围内线性良好,定量下限为1.172 ng·mL-1,日内与日间精密度均小于10%,绝对回收率为70.6%~80.6%,相对回收率为91.0%~106.7%,长期、短期以及反复冻融稳定性良好。2、5、10 μg·mL-1欧前胡素组的A2780/Taxol与K562/ADR细胞内的蓄积倍数分别为2.79、3.53、4.18与2.18、2.36、2.39。结论:本方法专属性强,灵敏度高,简单可靠,适用于检测肿瘤耐药细胞悬液中Rho 123的浓度,可用于细胞中P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的活性和功能评价。欧前胡素对肿瘤耐药细胞中P-gp介导的Rho 123外排具有抑制作用。
关键词罗丹明123(Rho123)    高效液相色谱-荧光检测法    欧前胡素    P-糖蛋白    肿瘤    
Effect of imperatorin on the content of Rho 123 in the drug-resistant cell suspension of tumor by HPLC-FLD
LI Zhi-yong1, WANG Chun-yan2, TANG Tao2, LIANG Xin-li2, ZHU Jing-yun1    
1. Department of Pharmacy, the Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330003, China;
2. Jiangxi University of Traditional Chineses Medicine, Nanchang 330004, China
Abstract: Objective: To establish a high performance liquid chromatography-fluorescence method for determining the concentration of Rho 123 in tumor multidrug resistance cell lines, and investigating the effect of imperatorin on Rho 123 content in cell.Method: The Rho 123 were extracted from cell lysis with protein precipitation by acetonitrile solution and supernatant separation was performed on Phenomenex-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)with temperature at 40℃. The elution with the mobile phase consisting of aqueous solution (1% triethylamine, adjusted to pH 4.0 with phosphoric acid) and acetonitrile at a flow rate of 1.0 mL·min-1 were applied for the chromatographic separation and the injection volume was 20 μL. The excitation wavelength was 485 nm, and the emission wavelength was 546 nm.Results: Methodological experiment results showed that the standard curve was Y=1.199 3X-4.003 69(R2=0.999 7), and the linear relationship was good in the range of 9.375-600 ng·mL-1. The lowest limit of quantification (LLOQ) of Rho 123 was 1.172 ng·mL-1. The intra-day and inter-day RSDs were both less than 10%. The absolute recovery rate was between 70.6% and 80.6%, the extraction recovery was between 91.0% and 106.7%. Rho 123 was stable in long-term, short-term and repeated freeze-thaw conditions. The accumulation ratios of A2780/Taxol and K562/ADR cells in the 2, 5, and 10 μg·mL-1 imperatorin groups were 2.79, 3.53, 4.18, and 2.18, 2.36, and 2.39, respectively.Conclusion: The method has strong specificity, high sensitive, simple and reliable, and is suitable for detecting the concentration of Rho 123 in cell suspension. It can provide a rapid and convenient method for evaluating the activity and function of P-glycoprotein(P-gp) in cells. Imperatorin can inhibit the excretion of Rho 123 which mediated by P-gp.
Keywords: Rhodamine 123(Rho 123)    HPLC-FLD    imperatorin    P-glycoprotein    tumor    

罗丹明123(Rho 123)是罗丹明系列染料中的1种,因其分子结构呈刚性平面状且具有较高的荧光量子产率,故荧光较强,是一种常见的荧光探针物质[1-2]。Rho 123是P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的经典底物,能够透过细胞膜,选择性地染色活细胞线粒体,因此Rho 123可广泛作用于P-gp功能及活性评价[3]、线粒体膜电位[4]、细胞凋亡[5]以及口服药物的吸收和分泌影响[6-7]。目前,国内外检测Rho 123主要采用流式细胞仪检测法[8]、荧光分光光度检测法[9]、HPLC法[10]、LC-MS法[11]、LC-MS/MS法[12]、微板读数器法[13]等,费用较高且均存在灵敏度低、操作烦琐费时等缺点。本研究旨在建立一种灵敏度高特异性强,样品处理简便的HPLC-荧光检测法,测定细胞悬液中Rho 123的蓄积,从而满足迅速测定对P-gp功能及活性评价、线粒体膜电位、细胞凋亡以及口服药物的吸收和分泌影响等研究的需要,为药代动力学、药物相互作用、肿瘤的发生以及多药耐药等的研究提供理论依据[12]

欧前胡素是来源于白芷、独活、当归等中药种的1种呋喃型香豆素成分,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性[13-14],课题组研究发现,欧前胡素可抑制P-gp介导如紫杉醇、硫酸长春新碱肿瘤药物外排,增加紫杉醇等药物的肠道转运及生物利用度[15-16]。Rho 123是P-gp底物,细胞悬液中Rho 123含量可反映P-gp的外排及筛选抑制P-gp功能的成分。因此,本文拟通过对P-gp底物Rho 123含量的测定,探讨欧前胡素增加紫杉醇等药物的肠道转运是否与抑制P-gp外排功能有关。

1 实验材料与仪器 1.1 细胞

人卵巢癌细胞株(A2780)、人卵巢癌耐紫杉醇细胞株(A2780/ Taxol)及人白血病细胞株K562、人白血病耐阿霉素细胞株K562/ADR均购于上海歌凡生物科技有限公司。

1.2 试剂

Rho 123对照品(Sigma公司,批号1012320000);对照品欧前胡素(批号110826-200712)、盐酸维拉帕米(批号100223-200102),中国食品药品检定研究院;考马斯亮蓝G-250(碧云天生物科技研究所);细胞裂解液(Solarbio,北京索莱宝科技有限公司);牛血清白蛋白(Solarbio,北京索莱宝科技有限公司);RPMI1640培养基(Hyclone,赛默飞世尔生物化学制品);胎牛血清(Gibco,赛默飞世尔生物化学制品);青霉素-链霉素(Solarbio,北京索莱宝科技有限公司);0.25%EDTA-胰蛋白酶(Gibco,赛默飞世尔生物化学制品);Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS)(without Magnesium with Calcium,Solarbio,北京索莱宝科技有限公司);乙腈(色谱纯,TEDIA公司);三乙胺(分析纯,南京化学试剂有限公司);磷酸(分析纯,上海化学试剂有限公司)。

1.3 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪与Agilent 1200荧光检测器,安捷伦科技有限公司;PHS-3C型pH计,上海精密科学仪器公司;多功能酶标仪(Tecan,Spark 10M);高速冷冻离心机(Sigma公司);BS124S型电子分析天平(Sartorius公司)。

2 实验方法与结果 2.1 HPLC-FLD测定肿瘤细胞中Rho 123含量方法的建立 2.1.1 检测条件

色谱柱:Phenomenex-C18柱(5 μm,250 mm×4.6 mm);流动相:乙腈-1%三乙胺(磷酸调pH=3.0)(28:72),流速:1 mL·min-1;柱温:40 ℃;进样量:20 μL;FLD条件:激发波长485 nm,发射波长546 nm。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取Rho 123对照品6.0 mg至25 mL棕色量瓶中,用乙腈定容,摇匀后即得质量浓度为240 μg·mL-1的Rho 123对照品储备液。采用逐级稀释法分别加入乙腈稀释Rho 123储备液,配制成质量浓度分别为30、15、7.5、3.75、1.875、0.937 5、0.468 8 μg·mL-1的一系列对照品溶液,置4 ℃保存。

2.1.3 样品处理 2.1.3.1 A2780与A2780/Taxol细胞培养

A2780与A2780/Taxol细胞培养在含10%的胎牛血清和100 U·mL-1青霉素、链霉素的RPMI1640培养基中,1×106个·mL-1接种于6孔板中,待细胞在板中生长融合至70%~80%,弃去完全培养基,用冰冷的Hank,s平衡盐溶液(HBSS)清洗2次,加入HBSS 500 μL,用细胞刮轻轻将细胞刮下,置于1.5 mL的EP管中,冻存于-80℃冰箱中以破碎细胞。反复冻融3次后,12 000 r·min-1离心10 min,取上清液。

A2780/ Taxol细胞株用含终质量浓度为100 0 ng·mL-1 Taxol的完全培养基维持其耐药性,实验前无药培养2周。

2.1.3.2 K562与K562/ADR细胞培养

K562与K562/ADR细胞培养在含10%的胎牛血清和100 U·mL-1青霉素、链霉素的RPMI1640培养基中,余下操作同“2.1.3.1”项下。

K562/ADR细胞株用含终质量浓度为1 000 ng·mL-1ADR的完全培养基维持其耐药性,实验前无药培养2周。

2.1.3.3 标准曲线及质控细胞悬液样品的处理

取空白的细胞裂解液180 μL,置于1.5 mL的EP管中,加入相应质量浓度的Rho 123对照品溶液20 μL,再与300 μL的乙腈混匀,涡旋3 min,140 00 r·min-1离心20 min后取上清液,将250 μL上清液与500 μL的流动相混匀,涡旋3 min,以0.22 μm的微孔滤膜过滤,用于HPLC分析。

2.1.3.4 待测细胞悬液样品的处理

取待测的肿瘤细胞的裂解液200 μL与300 μL的乙腈混匀,涡旋3 min,14 000 r·min-1离心20 min后取上清液,将250 μL上清液与500 μL流动相混匀,涡旋3 min,以0.22 μm的微孔滤膜过滤,用于HPLC分析。

2.1.4 方法学考察

本文考察了4种细胞的方法学,分别为K562、K562/ADR、A2780、A2780/Taxol,结果表明各细胞间无显著差异,因此,本文仅附K562/ADR细胞的方法学研究结果。

2.1.4.1 专属性

分别将3份不同来源的空白细胞裂解液、Rho 123细胞对照品标准液、给予Rho 123细胞裂解液样品,按“2.1.3”项下方法处理并进行HPLC分析。在上述色谱条件下,测得空白细胞组溶液、对照品溶液、细胞样品溶液的色谱图,如图 1所示:分析物Rho 123有较大的色谱峰,不受杂峰的干扰,基线噪音小,方法专属性良好,保留时间约为9.92 min,具有良好的特异性和分离度。

图 1 Rho 123空白细胞组溶液(A)、Rho 123对照品溶液组(B)、给予Rho 123的细胞样品溶液组(C)专属性HPLC色谱图 Fig.1 Specificity HPLC of solution of solution of blank cell(A), Rho 123 reference substances(B), and solution of cell sample with Rho 123(C)
2.1.4.2 标准曲线与定量下限

细胞悬液中Rho123在质量浓度为3.516 ~600 ng·mL-1内线性关系良好,得到的标准曲线:

Y=1.199 3X-4.003 6 R2=0.999 7

采用逐级稀释法,检测到Rho 123的定量下限为1.172 ng·mL-1(S/N=10.1),检测下限0.367 ng·mL-1(S/N=3.1)。

2.1.4.3 精密度试验

连续3 d用空白细胞液配制低、中、高质控样品即含Rho123质量浓度为3.516、75、600 ng·mL-1系列浓度标准样品各6份,进行处理并分析,计算其浓度,考察日间和日内精密度。质控样品与标准曲线同批测定,通过随行标准曲线来计算质控样品的浓度。日内平行测定6次,计算日内精密度;每日测定1次,连续3 d,计算日间精密度。结果Rho 123的日内精密度为1.4%~4.9%,日间精密度为2.8%~7.4%,小于10%,重复性好,符合要求。

2.1.4.4 回收率试验

用空白细胞液配制含Rho 123低、中、高的质控样品各6份,然后用乙腈配制与Rho 123低、中、高质控相等浓度的对照质控样品各6份,进行处理,各取20 μL进行HPLC检测,记录色谱图。结果见表 1

表 1 回收率结果(x±SD,n=3) Tab.1 Results of recovery
2.1.4.5 稳定性考察

用空白细胞液配制含Rho123低、中、高的质控样品各3份,分别测定样品在室温条件下放置24 h、-80 ℃储存15 d以及3次冷冻-解冻循环后的稳定性(每次在-80 ℃冰箱中放置12 h)。结果见表 2。表明样品稳定性均良好。

表 2 稳定性结果(n=3) Tab.2 Results of stability tests
2.2 欧前胡素对肿瘤细胞内Rho123含量的影响

按“2.1.3”项下方法培养各细胞,并接种于6孔细胞培养板中,过夜后,分别给予不同浓度的药物溶液或HBSS,置于37 ℃,5% CO2细胞培养箱中孵育,60 min后置于冰上终止反应(约10 min),1 000 r·min-1,4 ℃条件下离心5 min,弃去上清液,加入冰冷的HBSS清洗2次。每孔加入含5 μg·mL-1 Rho 123的HBSS液1 mL,置于37 ℃,5% CO2细胞培养箱中孵育60 min,结束后,置于冰上终止反应(约10 min),弃去上清液,加入冰冷的HBSS清洗2次。加入HBSS 500 μL并用细胞刮轻轻地将细胞刮下来,置于1.5 mL EP管中,冻存于-80 ℃冰箱中以破碎细胞。反复冻融3次,12 000 r·min-1离心10 min后取上清液。按照“2.1.3”项下的处理方法处理样品,同时取适量的细胞悬液按照Bradford蛋白浓度测定方法进行蛋白定量。将每管细胞内的Rho 123浓度与相应每管的总蛋白含量相除,用以消除每管细胞数量所带来的误差。实验分组及加样顺序见表 3。欧前胡素对不同肿瘤细胞中Rho 123含量的影响结果见表 45

表 3 不同浓度的欧前胡素对肿瘤细胞内Rho 123的蓄积实验分组 Tab.3 Groups for concentration-dependency of the effects of imperatorin on storage experiment of Rho 123 on cancer cells

表 4 欧前胡素对A2780/Taxol细胞内Rho123的蓄积影响(x±SD,n=6) Tab.4 Effect of imperatorin on Rhodamne 123 accumulation in A2780/Taxol cells

表 5 欧前胡素对K562/ADR细胞内Rho123的蓄积影响(x±SD,n=6) Tab.5 Effect of imperatorin on Rhodamne 123 accumulation in K562/ADR cells

A2780/ Taxol与A2780相比,细胞内Rho123含量明显降低,表明A2780/ Taxol耐药性形成,A2780/Taxol细胞株的P-gp的高表达将进入细胞内的Rho123更多地排出细胞外。在欧前胡素的作用下,Rho123在A2780/ Taxol细胞内的蓄积情况出现改变,表现为随着欧前胡素浓度的增加,Rho 123的蓄积逐渐增加,外排逐渐减少。2、5、10 μg·mL-1欧前胡素组的A2780/ Taxol细胞内的蓄积倍数分别为2.79、3.53、4.18,且各组与A2780/ Taxol阴性对照组相比具有统计学意义(P < 0.05),提示欧前胡素具有增加A2780/ Taxol细胞内Rho 123蓄积的作用,且与欧前胡素的浓度相关,但作用能力稍低于维拉帕米。

K562/ADR与K562相比,细胞内Rho 123含量明显降低,表明K562/ADR耐药性形成,K562/ADR细胞株的P-gp的高表达将进入细胞内的Rho 123更多地排出细胞外。在欧前胡素的作用下,Rho 123在K562/ADR细胞内的蓄积情况出现明显变化,随着欧前胡素浓度的增加,Rho 123的蓄积逐渐增加,外排逐渐减少。2、5、10 μg·mL-1欧前胡素组的K562/ADR细胞内的蓄积倍数分别为2.18、2.36、2.39,且各组与K562/ADR阴性对照组相比具有统计学意义(P < 0.05),提示欧前胡素具有增加K562/ADR细胞内Rho 123蓄积的作用和抑制P-gp外排的作用,且与欧前胡素的浓度相关。

3 讨论

本研究采用HPLC-荧光检测法测定细胞悬液中Rho 123的蓄积,解决了流式细胞仪检测法费用昂贵,荧光分光光度法灵敏度低、数据偏差较大、重现性差, LC-MS与LC-MS/MS法操作烦琐的问题,可在大多数实验室普及。

根据Rho 123分子结构呈刚性平面状且具有较高的荧光量子产率,可使其荧光较强[1-2],采用HPLC-荧光检测器测定Rho 123在细胞内的蓄积影响,能够消除HPLC灵敏度有限的劣势,且该检测器较为普及,具有较高的实用价值。目前,常用的蛋白沉淀剂有甲醇、乙腈、乙酸乙酯以及三氯甲烷。本实验通过考察甲醇、乙腈对细胞裂解液混合条件下Rho 123提取回收率的影响,结果表明使用乙腈沉淀蛋白的能力较甲醇更高,回收率在96.4%以上,符合样本的测定要求。本方法成功用于研究细胞内Rho 123的蓄积影响,表现为随着欧前胡素浓度的增加,Rho 123的蓄积逐渐增加,外排逐渐减少,故本方法能够满足对P-gp功能及活性评价、线粒体膜电位、细胞凋亡以及口服药物的吸收和分泌影响等研究的需要,为药代动力学、药物相互作用、肿瘤的发生以及多药耐药等的研究提供理论依据。

化学治疗在恶性肿瘤的综合治疗中占有非常重要的地位,与手术治疗、放射治疗一起,成为恶性肿瘤治疗的3把利剑,但临床上肿瘤的多药耐药(multidrug resistance,MDR)对疗效的影响十分严重,通过跨膜转运蛋白的外排泵作用,可以降低多药耐药。P-gp是重要的外排转运蛋白,许多一线临床广泛使用的药物均受其影响,导致肿瘤的多药耐药的发生,如多柔比星、紫杉烷类、长春花生物碱类等。近年来研究发现,中药活性成分在逆转多药耐药方面具有很好的疗效,以中药为研究对象,筛选P-gp逆转剂引起了研究者的广泛重视。结合前期研究结果及本次实验发现,欧前胡素具有抑制P-gp外排药物的功能,其作用机理尚需进一步深入研究。

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