2019, Vol. 39 
表1(Table 1)
2. 中国医学科学院 & 北京协和医学院医学生物学研究所, 昆明 650118;
3. 云南省科学技术院, 昆明 650051
2. Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Kunming 650118, China;
3. Yunnan Provincial Academy of Science and Technology, Kunming 650051, China
人类肠道病毒(human enterovirus)作为小RNA病毒科中的主要群属，包括脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)A组和B组、肠道孤儿病毒(echovirus，埃可病毒)等[1-3]，这类病毒可以在临床上引起多种形式的疾病，主要的感染对象以5岁以下儿童居多，因而其临床病理机制及其免疫学特性均受到了广泛的关注[4-6]。已有的资料表明，这类病毒在经肠道粘膜上皮感染后，即可进入循环系统引起次级靶器官(包括心脏、脑等组织)的病理损伤，同时引起机体的特异性免疫应答[6]。尽管在依据许多科学研究的实践认识中，针对重要肠道病毒的疫苗，尤其是针对脊髓灰质炎病毒的减毒及灭活疫苗已经取得了良好的效果[7]，但这类病毒在感染过程中如何与免疫系统相互作用而引起免疫反应的具体机理仍然不够清楚。近期针对肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)及柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus group A type 16，CA16)的灵长类动物研究表明，2种病毒在进入粘膜上皮组织后，除了引起上皮细胞的感染损伤外，均能感染粘膜组织中的未成熟树突状细胞[8]。同时，在病毒检测为阳性的灵长类动物病毒血症的样品中，病毒被发现存在于外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中[9]。这些结果提示了肠道病毒在感染机体的同时，与相关的免疫细胞可能有某种联系。基于这些观察，本文进一步观察了同为肠道病毒成员的埃可病毒6型(echovirus type 6，Echo 6)对恒河猴免疫细胞的感染特征。结果提示，Echo 6型病毒与EV71和CA16病毒类似，均能感染恒河猴的未成熟树突状细胞，并在其中呈现了动力学的增长过程。这一结果为认识肠道病毒与机体免疫系统的相互作用提供了新的资料。
1 材料与方法 1.1 病毒与细胞Echo 6病毒株(D’ Amori株)由中国医学科学院医学生物学研究所病毒免疫室分离保存。非洲绿猴肾细胞系Vero购自ATCC(American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA)，使用含100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素、10%新生牛血清的MEM培养基(Minimum Eagle’s Medium)在5% CO2 37 ℃条件下进行传代培养。
1.2 主要试剂及仪器粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，2 μg)，PeproTech公司；重组人白细胞介素-4(IL-4，2 μg)，PeproTech公司；RPMI-1640培养基(RPMI-1640)，Gibco公司； One Step SYBR Prime Script RT-PCR Kit，TaKaRa公司；新生牛血清(NBS)，兰州民海生物制品有限公司；胎牛血清(FBS)，Corning公司；人外周血淋巴细胞分离液，Bioligical Industries公司；牛血清白蛋白(BSA)，Amresco公司；EDTA抗凝管(10 mL)，BD公司；Fc受体封闭液和非DC细胞去除抗体组分，Miltenyi Biotec公司；免疫磁珠分选试剂盒、LD分离柱和MS分离柱，Miltenyi Biotec公司；特异性抗体APC anti-CD80、PE/Cy7 anti-CD86、FITC anti-CD83、APC anti-CD1c，BD公司；Simply P总RNA提取试剂盒，杭州博日科技有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4，0.01 mol·L-1)，Gibco公司。主要仪器为分选型流式细胞仪(型号influx，BD公司)；实时定量PCR仪(型号CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System，Bio-Rad公司)。
1.3 动物伦理实验动物恒河猴由中国医学科学院医学生物学研究所按照《实验动物福利伦理审查指南》进行实验动物的饲养和质量管理，遵循实验动物伦理，善待实验用动物。按照《关于善待实验动物的指导性意见》对实验动物进行相关福利和安死术。采取的恒河猴血液和骨髓样品方法遵循国际、国家或者机构动物保护和使用指南。
1.4 恒河猴树突状细胞的分离及培养 1.4.1 外周血单核细胞来源的树突状细胞 1.4.1.1 外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的分离使用EDTA抗凝管收集恒河猴的新鲜血液，加入等量RPMI-1640培养基混匀，所得的混悬液小心加于同样体积的淋巴细胞分离液中。1 800 r·min-1、4 ℃离心30 min，小心吸取环状乳白色淋巴细胞层至新的离心管中，加入适量的RPMI-1640培养基溶液充分混匀。1 800 r·min-1、4 ℃离心15 min。细胞沉淀用RPMI-1640培养基溶液清洗2次分离得到PBMC。
1.4.1.2 免疫磁珠分选CD1c+树突状细胞将含1×108个PBMC单细胞悬液离心(1 800 r·min-1、4 ℃)10 min，去除上清液，加入120 μL分选缓冲液重悬细胞。加入80 μL Fc受体封闭液和非DC细胞去除抗体组分，混匀后4 ℃避光孵育15 min，加入10 mL缓冲液清洗，之后再加入10 mL缓冲液重悬(使用枪头轻轻吹打重悬细胞)。制备的细胞悬液全部加入LD分离柱中，该柱可吸附去除如B细胞等非树突状细胞成分。滤过的细胞悬液再与树突状细胞的富集抗体成分混匀，4 ℃避光孵育15min，清洗细胞，然后通过含磁性抗体的MS分离柱，利用抗原抗体相互作用原理，分离纯化CD1c+的树突状细胞。由于树突状细胞表面标志抗体(CD1c)携带磁珠(磁性抗体)，可以特异结合CD1c+树突状细胞，使用MS分离柱将特异细胞吸附在MS柱上，其他细胞被去除，后再加1 mL洗脱液洗脱收集CD1c+树突状细胞。
1.4.1.3 CD1c+树突状细胞的培养使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基(含10 ng·mL-1 GM-CSF，20 ng·mL-1 IL-4)，于6孔板中培养CD1c+树突状细胞(1×106 cells·mL-1)。37 ℃、5% CO2培养箱中培养，培养时间不超过24 h，用于病毒感染试验。
1.4.2 骨髓源树突状细胞 1.4.2.1 骨髓源树突状细胞的分离恒河猴处死后，剪开皮肤及软组织，取胫骨和股骨，使用无菌预冷PBS冲洗骨髓腔，过滤，收集滤液，1 000 r·min-1、4 ℃离心5 min。弃上清，加入红细胞裂解液2 mL，冰上放置15 min，待细胞液为澄清透亮时，1 000 r·min-1、4 ℃离心10 min，10 mL PBS洗涤细胞。
1.4.2.2 骨髓源树突状细胞的培养用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液1 mL重新轻轻吹打悬起，再将细胞悬液均分转移至6孔培养板内，37 ℃恒温箱培养12 h后，添加稀释好的细胞因子重组人GM-CSF(20 µg·mL-1)和IL-4(10 µg·mL-1)的RPMI-1640完全培养液继续培养。培养第6天后，将细胞分为2组，1组为未成熟树突状细胞，另1组为加入细胞因子TNF-α(10 µg·mL-1)继续培养的成熟树突状细胞。培养第8天后即可收集细胞使用。
1.5 流式细胞分选将上述细胞液收集至1.5 mL EP管中, 1 000 r·min-1、4 ℃离心10 min后，加入RPMI-1640培养液1 mL重悬。细胞悬液中加入相应的表面标记抗体APC anti-CD80、PE/Cy7 anti-CD86、FITC anti- CD83、APC anti-CD1c各5 μL。阴性对照组不加抗体，4 ℃条件下避光孵育30 min。再加入RPMI-1640培养液1 mL洗涤，1 000 r·min-1、4 ℃离心5 min，加RPMI-1640培养液1 mL重悬细胞后，24 h内利用流式细胞仪上机检测分选。
1.6 Echo 6型病毒滴度的测定病毒样品用无血清RPMI-1640培养基作连续10倍梯度稀释，取不同稀释度的病毒加入含Vero细胞(每孔1×104 cells)的96孔板中。置37 ℃，含5% CO2培养箱中孵育5 d后，用光学显微镜检查细胞病变情况(Cytopathic effect，CPE)，判断结果以50%以上细胞病变为阳性。用Karper法计算病毒滴度。
1.7 病毒感染细胞利用滴度为6.0 lgCCID50的Echo 6型病毒，以感染复数(multiplicity of infection，moi)=0.1接种细胞，37 ℃恒温箱孵育1 h后，用无血清RPMI-1640培养基2 mL洗涤去除未吸附的病毒，加入含8%胎牛血清的RPMI-1640培养基2 mL，在5% CO2、37 ℃恒温箱中培养。在感染的特定时间点(0、12、24、36、48、60、72、84 h)收集样品，检测相应病毒滴度。
1.8 流式细胞检测取病毒感染0、24和48 h的未成熟树突状细胞组，分别加入荧光抗体5 μL进行染色标记，阴性对照组不加抗体，4 ℃避光孵育30 min，1 mL无血清RPMI-1640培养基洗涤，1 000 r·min-1、4 ℃离心10 min后，加入1 mL RPMI-1640培养基重悬细胞后上机检测。
1.9 RNA提取病毒以moi=0.1感染树突状细胞并于感染后每12 h收集细胞样品，按照Simply P总RNA提取试剂盒说明，提取总RNA。细胞混悬液先进行离心(1 800 r·min-1、4 ℃、10 min)。弃上清，600 μL裂解液裂解细胞后吸入纯化柱，加入试剂盒中的洗涤液600 μL，共洗涤2遍，之后用40 μL TE溶液洗脱，获得总RNA。
1.10 实时定量PCR各个时间点的RNA样品利用One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit测定IL-6与TNF-α基因mRNA的表达水平。反应条件:逆转录42录件为RK，95录10 s，再进行PCR反应95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，40个循环。引物序列详见表 1。
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表 1 引物序列 Tab.1 Primer sequences |
采用SPSS19.0统计软件对数据进行统计分析，t-test检验比较2组间的差异，2组间若有显著性差异，则P < 0.05。
2 结果 2.1 恒河猴树突状细胞的分离培养基于本实验室以往针对恒河猴树突状细胞培养的方法[1]，本文探索2种获取猴树突状细胞的可能方式:其一是从猴外周血PBMC中根据树突状细胞表面特有标记收集细胞；其次是利用猴骨髓细胞在特定细胞因子的刺激下诱导树突状细胞的分化而获得细胞。2种方法的结果表明，利用恒河猴外周血PBMC通过流式分选产生的树突状细胞以成熟期树突状细胞(CD1c+/CD83+)稍多，而未成熟树突状细胞(CD1c+/CD86+)比例略少(图 1-a)；而利用恒河猴骨髓来源细胞经GM-CSF和IL-4刺激培养后诱导分化的树突状细胞(图 1-b)则以未成熟细胞为主(图 1-c)。为了对Echo 6型病毒感染树突状细胞具体特征进行详细研究，这2类树突状细胞均用于后续试验。
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a.外周血PBMC来源的成熟与未成熟的树突状细胞(mature and immature dendritic cells derived from PBMC of peripheral blood) b.骨髓细胞经特异细胞因子刺激诱导的树突状细胞形态(诱导后0、4、8 d)，*，P < 0.05 [the morphology of dendritic cells from bone marrow cells induced by specific cytokines stimulation (0，4 and 8 days after induction)，*，P < 0.05] c.骨髓来源的成熟与未成熟的树突状细胞(mature and immature dendritic cells derive from bone marrow) 图 1 恒河猴树突状细胞分离培养 Fig.1 Isolation and culture of dendritic cells from rhesus monkey |
首先，分析Echo 6型病毒感染未成熟树突状细胞(CD1c+/CD86+)的情况。在moi=0.1的情况下，Echo 6型病毒感染由骨髓细胞诱导分化的未成熟树突状细胞，病毒在感染后12 h即出现了明显的病毒增殖趋势，之后病毒滴度依然不断增加(图 2)。Echo 6型病毒在这些未成熟树突状细胞中的增殖曲线类似于病毒感染易感的Vero细胞(图 2)。这一病毒增殖动力学特点提示，Echo 6型病毒可在未成熟树突状细胞中增殖传代。
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图 2 Echo 6型病毒在恒河猴未成熟的树突状细胞中增殖情况(*，P < 0.05) Fig.2 The proliferation of Echo 6 virus in the immature dendritic cells from rhesus monkeys (*, P < 0.05) |
在使用Echo 6型病毒感染未成熟树突状细胞的同时，利用从猴外周血PBMC分离的成熟树突状细胞(CD1c+/CD83+)，进一步探讨了Echo 6型病毒对其的感染能力。Echo 6型病毒以moi=0.1的条件下感染培养的成熟树突状细胞，与在易感Vero细胞中病毒增殖不同的是，在成熟树突状细胞中病毒未出现明显的增殖曲线，病毒滴度始终维持在4.0左右，甚至出现随着时间延长滴度反而降低的现象(图 3)，提示该病毒不能在成熟的树突状细胞中增殖。
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Echo 6型病毒在外周血PBMC中分离诱导的成熟树突状细胞(bmDC)和髓系细胞诱导分化为成熟树突状细胞(mmDC)中增殖情况(*，P < 0.05) [proliferation of Echo 6 virus in the mature dendritic cells from PBMC of peripheral blood (bmDC) and those from bone marrow cells (mmDC) (*，P < 0.05)] 图 3 Echo 6型病毒在恒河猴成熟的树突状细胞中增殖情况 Fig.3 The proliferation of Echo 6 virus in the mature dendritic cells from rhesus monkeys |
为进一步验证这一实验结果，使用上述骨髓来源诱导分化的未成熟树突状细胞(CD1c+/CD86+)，加入TNF-α刺激其转化为成熟状态的树突状细胞(CD1c+/CD83+)后，再感染Echo 6型病毒。但其增殖动力学结果仍然未观察到显著的病毒增殖情况(图 3)，病毒增殖曲线与病毒感染PBMC来源的成熟树突状细胞趋势类似(图 3)。上述结果提示，Echo 6型病毒的确不能在成熟状态的树突状细胞中增殖传代。
2.4 Echo 6型病毒感染猴树突状细胞可以上调TNF-α和IL-6的表达为了进一步确证Echo 6型病毒感染猴树突状细胞这一现象，对未成熟树突状细胞(CD1c+/CD86+)、感染Echo 6型病毒的未成熟树突状细胞(CD1c+/CD86+)在不同时间内的TNF-α转录表达量和IL-6转录表达量都做了mRNA水平上的检测。结果表明，与对照比较，感染了Echo 6型病毒的未成熟树突状细胞中TNF-α和IL-6转录表达水平均明显上升(图 4-a)。对感染后48 h的未成熟树突状细胞的表面标记进行检测，可以观察到这些细胞的表面标记已由先前未成熟状态的特有标记CD1c+/CD86+转变为成熟状态的标记CD1c+/CD83+为主的群体了(图 4-b)。
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a. Echo 6型病毒感染树突状细胞后TNF-α(矩形)和IL-6(圆点)的表达变化；y轴显示感染组特定基因与对照组该基因表达水平的变化倍数(对照组基因表达水平y=1，点状线) (*，P < 0.05；**，P < 0.01)[expression of TNF-α (rectangle) and IL-6 (spot) in Echo 6-infected dendritic cells. The y-axis indicates the relative fold changes of the specific mRNA in the infected group compared with those of the control group (the mRNA expression in control y=1，dot line) (*，P < 0.05；**，P < 0.01)] b:Echo 6型病毒感染树突状细胞后表面标记的变化(surface markers of Echo 6-infected dendritic cells) 图 4 Echo 6型病毒感染树突状细胞后细胞因子表达及表面标记的变化情况 Fig.4 Changes of cytokine expression and surface markers of Echo 6-infected dendritic cells |
人类肠道病毒是一类结构清楚，患者临床表现特征明确的病毒病原[1, 10]。长期以来的病原学研究表明，这类病毒可以感染人体的多种上皮细胞，如肠道上皮细胞、呼吸道上皮细胞以及其他部分上皮类细胞[11-12]。同时，相关的研究亦证实，多数肠道病毒感染机体后，可以刺激免疫系统引起相应的特异性免疫反应[13-14]，主要表现为血清中抗病毒中和抗体和针对特异性抗原的细胞免疫反应[15]。因此，部分肠道病毒已成功地制备了相应的疫苗，如脊髓灰质炎减毒及灭活疫苗、甲肝减毒及灭活疫苗[7, 16]，以及新近上市的EV71疫苗[17]。尽管如此，针对肠道病毒与机体免疫系统相互作用的研究工作中仍有一些不甚明了的内容。在针对与EV71同时作为人类手足口病病原的CA16疫苗相关研究中注意到，2种病毒均能够感染人体外周组织中的树突状细胞[18-19]，而且有意思的是，CA16对未成熟树突状细胞的感染能够促进感染细胞的成熟过程[19]。同时，细胞的生物表型亦会出现相应的变化[19]。这些工作提示，肠道病毒在感染机体的过程中，与免疫系统之间可能存在一种更重要的作用，即通过感染具有抗原递呈功能的树突状细胞来影响免疫反应的形成[20]。这是否为个别肠道病毒的特征，还是所有肠道病毒中的一种生物学共性，值得进一步的观察。基于这一考虑，本文的工作选取了同样作为肠道病毒的Echo 6型病毒，经过对其的增殖培养，制备稳定滴度的病毒液。同时，基于前期的工作，采用流式细胞仪分离了恒河猴的外周血及骨髓来源的树突状细胞，并依据其表面标志分子的不同，将CD1c+/CD83+的未成熟树突状细胞与CD1c+/CD86+的成熟树突状细胞分群培养，并以一定滴度的Echo 6病毒分别感染2类细胞。在同样滴度的病毒感染Vero细胞对照下，观察了该病毒在2类树突状细胞中的增殖动力学特征。同时，观察了感染细胞的表性特征。这些结果初步证实了Echo 6型病毒与EV71和CA16同样具有感染树突状细胞的能力，而且该感染可以促进未成熟树突状细胞向成熟树突状细胞转化，并使感染细胞分泌IL-6和TNF-α的能力出现变化。这一与EV71和CA16病毒类似的生物学特征，似乎提示，对树突状细胞的感染并促进该细胞由未成熟状态向成熟状态转化的生物学现象可能是肠道病毒的一个共同的生物学特征。这一特征对于认识肠道病毒与机体的相互作用及其病理学和免疫学意义有很好的参考意义。当然，针对每一个肠道病毒成员在此过程中的具体机理，尚需要深入的讨论。
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