2019, Vol. 39 
2. 康希诺生物股份公司, 天津市呼吸道细菌重组及结合疫苗企业重点实验室, 天津 300457;
3. 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所, 蛋白质组学国家重点实验室, 北京蛋白质组研究中心, 国家蛋白质科学中心-北京, 北京 102206
2. CanSino Bio Corporation, Tianjin Key Laboratory of Recombinant Bacterial Recombination and Bacterial Conjugation, Tianjin 300457, China;
3. State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, National Center for Protein Sciences(Beijing), Beijing Institute of Lifeomics, Beijing 102206, China
基因工程药物，是通过重组技术将目的基因导入大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞等宿主细胞，构建工程菌株或细胞株，再经过特定的表达、组装、折叠与翻译后修饰等过程所产生的具有相应生物活性的大分子[1]。源自宿主细胞的内源性蛋白被称为宿主细胞蛋白(host cell proteins，HCPs)，其组成复杂，根据所选取的宿主细胞和生产工艺不同，通常HCPs的等电点(3~11)、疏水性、相对分子质量(一般5 000~250 000)分布差异显著[2]。
基因工程药物中的细胞HCPs在用药时可能导致不同的人体反应，因为特定的HCPs具有潜在的“佐剂效应”，产生针对HCPs杂质的免疫应答，或引起过敏性反应，甚至过敏性休克。除安全问题外，HCPs的存在也会影响产品质量。例如，HCPs可以引发治疗性蛋白质的聚集或片段化。另外发现，某些HCPs促进聚山梨酯的降解，而聚山梨酯是广泛用于配制缓冲液以稳定蛋白质的一类非离子表面活性剂，其降解会影响蛋白质药物的稳定性。HCPs中的蛋白酶活性还可影响培养上清液中的蛋白质组成，从而影响后续蛋白纯化过程[3-4]或蛋白质药物长期储存的稳定性[5]。此外，HCPs可能发生翻译后修饰[3]，使定量和表征更加困难。鉴于基因工程药物中细胞的HCPs可能导致安全性和有效性问题，其去除效率与细胞限的检测是药物放行并进行临床研究的重要参数，是药物质量控制的关键产品质量属性(critical quality attribute，CQA)之一[6]。因此，尽管迄今为止只有少数的临床不良事件归因于HCPs杂质，但为了保证产品的安全性，必须通过灵敏度高的分析方法对HCPs进行准确定性定量分析。
本文从HCPs的影响因素出发，结合相关法规对HCPs的质控要求，综述了HCPs的相关研究方法，并详细介绍了质谱检测HCPs的最新进展，比较了各种方法之间的优劣势，提出了HCPs的控制方法，为后续的HCPs研究奠定基础。
1 HCPs的影响因素
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表 1 主要影响HCPs的因素[7] Tab.1 Main influencing factors of HCPs |
HCPs的数量和组成受整个生产工艺过程的影响。表达途径很重要，根据宿主细胞和培养条件的不同，其HCPs的种类差异较大，变化范围可以从几百到几千。许多宿主细胞如大肠杆菌、哺乳动物细胞、NSO、SP2/0和人胚胎肾细胞系HEK293已用于生物制药生产。在哺乳动物细胞培养过程中，重组蛋白通常从细胞分泌到细胞培养液(cell culture fluid，CCF)中，其中包含HCPs。另外，由于一些细胞死亡，可溶性细胞内蛋白被释放到CCF中，一些人为操作方式(如离心、过滤等)也会造成细胞裂解。因此，收获的CCF通常含有分泌型HCPs和细胞内HCPs。当这种蛋白混合物在发酵罐中孵育时，由于酶活性(例如蛋白酶或唾液酸酶)，还会造成HCPs的其他变化[2]。
HCPs分析提供了进入下游工艺的有关物质组成信息以及每个纯化步骤对HCPs的清除率[8]。在某些情况下，HCPs甚至可以与某些蛋白药物结合或共同纯化。需要进行过程表征和验证研究，以说明哪些工艺步骤可以去除HCPs，并且还需要证明这些步骤清除HCPs的稳定性。因此，HCPs检测是纯化工艺开发的重要组成部分，且有助于确保生产一致性。最后，需要稳定的且灵敏度高的检测方法来检测药物蛋白的HCPs。
2 以CHO表达体系为例简介HCPs的分析方法 2.1 质控内容及要求目前，国际上针对HCPs的细胞限量尚无统一标准，生物制药公司采用风险控制来控制HCPs的细胞量[3]。任何基因工程药物的生产和纯化之后，在最终药物蛋白中通常会发现微量的HCPs。美国FDA规定，用一种灵敏度较高的方法检测药品中的HCPs，其含量应该低于检测下限100 ppm (100 ng·mg-1总蛋白)的相对值，通常被认为是工艺开发的重要参考点[9]。HCPs水平应在以下几项中进行监测:1)用于毒理学评估的临床前批次；2)临床开发期间的所有批次；3)最终生产过程中的工艺验证样品。
2.2 研究方法在工艺开发和生产过程中，对HCPs等杂质的检测要选择适当方法，而其定量方法一直都受到关注。目前，定性或半定量方法可能足以用于过程样品和批次检测。通常，用于HCPs分析的方法有免疫分析方法(例如Western Blot[10]和ELISA[10-13])或其他方法(例如电泳[8, 14-15]和质谱[9, 16-18])，多种技术可以并行或结合进行研究。此外，还出现了新型检测方法，但因不够成熟而尚未广泛使用。
2.2.1 ELISA法在HCPs分析的方法中，抗HCPs ELISA被认为是金标准。此方法(1~100 ppm)适用于产品开发和过程控制。但与常规ELISA不同，抗HCPs ELISA靶向不单一，总HCPs“抗原”是复杂的蛋白质群。因此，在生产HCPs抗体/标准试剂时，要确保:1)特定的生产细胞系和生产过程；2)其蛋白质浓度要准确定量。一般HCPs抗体的制备方法是用含空表达载体的宿主细胞制备抗原免疫动物，获得抗血清，分离纯化的多克隆抗体用于ELISA检测。由于HCPs作为抗原的免疫原性取决于蛋白质本身的结构、性质、丰度与相对分子质量等因素，所以在分析过程中会存在不同的检测结果[10](图 1)，这在一定程度上会造成定量结果的不准确。
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①理论结果(theoretical result) ②报告抗体未结合到HCPs导致检测不到(reporting antibody did not bind to HCPs resulted in no signal) ③体系中未被洗掉游离的HCPs(free HCPs were not washed) ④体系中未被洗掉游离的HCPs可能结合上了报告抗体导致出现微弱信号(free HCPs which were not washed away may bind to reporting antibody and caused a weak signal) 图 1 ELISA检测HCPs可能出现的结果[1] Fig.1 Possible results of HCPs by ELISA |
此外，商品化的试剂盒无法涵盖所有过程特异性的HCPs，无法识别由于工艺改变等引起的HCPs改变等问题。如果使用其他的结合和检测抗体，建议测试检测抗体的覆盖率。HCPs覆盖率评估有助于评估抗体并识别标准中的HCPs以及生产过程和蛋白药物产品中存在的HCPs的能力。HCPs免疫分析的设计和验证是挑战，这是由于:1)方法动态范围较窄(< 100)，开发周期长，费用高，失败风险高；2)基因工程药物中可能的HCPs种类繁多；3)一般使用多克隆抗体试剂来检测，结果会出现图 1所述的情况；4)不同的蛋白质有相似的抗原表位，导致出现假阳性；5)Hook效应，高丰度蛋白导致检测饱和；6)HCPs抗原组成应该足够全面，以耐受产品正常生产过程变化；7)缺少完全匹配的定量标准。由于HCPs检测是用来检测含有HCPs的样本，任何抗HCPs抗体与药物蛋白的交叉反应都会影响检测并导致结果有偏差。因此，必须避免HCPs抗原的污染。在未来一段时间，可以预期ELISA仍然是检测HCPs的金标准，但为了使这种检测方法更准确，选择合适的抗体至关重要。
2.2.2 凝胶电泳/Western-Blot法凝胶电泳[3, 19]通常用于生物制药开发实验室，以对样品中存在的不同蛋白质进行半定量分析。对于HCPs分析，一维的SDS-PAGE凝胶不具有高分辨度，而是与Western-Blot结合使用。二维电泳(2-DE)常用于上游或下游工艺开发和表征，其在单一凝胶上分辨不同HCPs的能力增强。2-DE的原理是先根据等电点(第一维)进行分离，然后根据大小(第二维)进行分离。凝胶中的斑点分析不需要免疫印迹，避免了转膜的问题，可以实现痕量HCPs杂质与产品的分离。提供蛋白质点的大概相对分子质量和等电点信息，但是过量的蛋白质可能会掩盖HCPs斑点。质谱技术常用于进一步鉴定胶内蛋白质。通常，凝胶电泳用作检测非免疫原性HCPs的补充方法。
Western-Blot用于大量样品的一致性筛选，以及检测与抗HCPs抗体反应的未知蛋白。它不仅适用于检测HCPs，而且还提供HCPs相对分子质量的大概信息，可用作GMP控制系统的一部分[3]。但Western-Blot也存在很大的问题:1)需要高质量的HCPs多克隆抗体；2)凝胶中大量过载的目的蛋白会导致条带的非特异性染色，从而掩盖HCPs可能出现的条带；3)SDS诱导的蛋白质变性可能导致构象表位的丢失；4)Western-Blot对于HCPs是不能准确定量的，实验的灵敏度取决于多克隆抗体的质量。
2.2.3 邻位连接分析法(proximity ligation assay，PLA)[3]PLA实验中，在2种针对不同抗原表位的抗体上标记寡核苷酸链(即PLA probe)，这些探针在相互接近时通过连接酶而连接，然后通过qPCR扩增并由此定量目标蛋白质(即HCPs)。Liu等[20]使用抗体偶联磁珠选择性结合HCPs并通过洗涤除去未结合的蛋白质，然后将磁珠与探针标记的抗体一起温育并开始qPCR来分析检测。该方法检测HCPs下限为0.25 ng·mL-1。然而，与常规ELISA不同，该方法需要3种靶向HCPs不同表位的抗体，这就限制了HCPs检测的灵敏度与检测范围。
2.2.4 生物传感器法Mattiasson等[21]报道了生物传感器用于生物制药生产中典型杂质的检测。生物传感器可以在线测定目标分子使其成为过程分析技术(process analysis technology，PAT)中有前景的分析工具。然而，与传统的免疫测定不同，生物传感器需要再生，因此建议使用弱亲和力抗体，但这是以牺牲灵敏度为代价的。Teeparuksapun等[22]开发了一种电容免疫传感器来测量HCPs浓度。免疫传感器可以运行25个循环，并显示对HCPs的选择性响应，但较低蛋白质浓度下会产生传感器与HCPs的非特异性相互作用，并要求蛋白间有一定水平的亲和力，这种方法对于在线检测HCPs浓度有一定意义，但与已建立的方法(例如ELISA或质谱)相比，其选择性和灵敏度尚有欠缺[3]。
2.2.5 质谱法近年来，质谱(MS)越来越多地应用于HCPs检测[7, 15]，帮助识别可能的风险因素，评估纯化过程。尽管ELISA最常用于检测HCPs的总量，但它不能识别ELISA试剂盒检测范围之外的HCPs，且与传统ELISA方法相比，液相色谱质谱联用(LC-MS)方法具有开发时间短，可特异性地对所有HCPs进行确证和定量，对所有杂质蛋白无偏性检测，且方法动态范围高(可达6个数量级)，方法调整快等优势。目前运用蛋白质组学方法对中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1[23]和中国仓鼠基因组[23]进行测序，已鉴定澄清细胞培养液中的大部分细胞外CHO蛋白质组，确定了约3 000种细胞外蛋白质，其中约1 000种蛋白质由细胞分泌[24]，这体现了质谱方法的优越性。
质谱分析药物蛋白中的HCPs时，主要障碍是药物蛋白的复杂性和高动态范围，因为药物蛋白通常比最丰富的HCPs多5~6个数量级[25-26]。通常先通过ProA或ProL去除高丰度药物蛋白，并收集纯化的流穿液。流穿液已经去除了药物蛋白，富集到细胞的HCPs，经过酶切处理，使用nano-UPLC-MS/MS分析，通过特定软件进行数据库搜索鉴定并定量HCPs[27-28]。使用该方法，从总HCPs水平非常低(< 1 ppm至10 ppm)的样品中可以鉴定出近700个HCPs[29]。最新研究表明，在未除去药物蛋白的情况下，这些方法仍可以鉴定并定量过程产品及最终产品的HCPs，HCPs液质分析策略图见图 2，目前基于质谱的最新研究有以下几种。
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图 2 HCPs液质分析策略图 Fig.2 Schematic diagram of HCPs LC-MS analysis strategy |
(1) DIA/SWATH MS
HCPs的串联质谱分析，常用的模式为数据依赖性采集(data dependent analysis，DDA)，但近年来数据非依赖采集(data independent analysis，DIA)，或称作SWATH (sequential window acquisition of all theoretical fragment ions)正在显示其优越的一面。DDA偏向于高丰度信号的采集，这会导致对低浓度HCPs的检测较差；DIA/SWATH的主要优点是可以获得所有洗脱前体的MS2信息，即使在低丰度的情况下，蛋白质的鉴定也具有很高的重现性。DIA/SWATH数据分析需要全面的检测数据库[30-31]，可通过DDA分析首先建立质谱谱图库，虽然DDA数据会导致谱图库偏向于高丰度蛋白，但可以通过样品预分级及相关样品(例如空白细胞裂解物和纯化初级阶段的样品)的分析检测以及靶向分析来增强谱图库的覆盖度。
DIA/SWATH检测HCPs的实验技术路线如图 3。首先利用DDA鉴定HCPs肽并确定选择要监测的目标肽段，DDA结果同时用作建立谱图库。然后采用DIA/SWATH策略，采集所有离子的MS2碎裂谱图[25]，并与DDA建立的谱图库结合得到定量数据。为了补偿样品在制备过程中的损失，可以在纯化样品中掺入蛋白质标准品。在这种情况下，蛋白标准品的所有损失都会反映HCPs的损失，具体实验流程如图 3所示。据报道，DIA/SWATH可以在大动态范围内对数千种肽进行准确的MS2定量[32]，而且不同实验室间的重现性很高[33]。Heissel等[25]采用DIA-LC-MS方法建立了从最初的细菌收获液和最终细菌蛋白产品的未经预分离与预分离样本的HCPs数据库，数据库用于指导最终细菌表达产品中HCPs的量化，其酶切后的肽段在80 min的梯度上分离并用SWATH采集获得。
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图 3 LC-MS-DIA实验技术路线图[25] Fig.3 LC-MS-DIA experimental technical roadmap |
(2) PRM质谱定量技术
与多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)[34]每次扫描1个离子对不同，平行反应监测(parallel reaction monitoring，PRM)[35]质谱检测技术对1个母离子产生的所有子离子进行全扫描。PRM技术具备MRM的靶向特点，包括高选择性、高灵敏度和高动态范围等，但基于高精度质谱的PRM技术具备了更高的鉴定准确度和定量通量。PRM目标肽段的选择，同样需要基于DDA鉴定的谱图库。Kreimer等[36]提出了一种新颖的数据独立采集(DIA)-MS工作流程，使用靶向和非靶向数据处理来鉴定HCPs肽，然后使用PRM进行验证和定量，使用DIA-Umpire进行非靶向的数据处理，用于鉴定数据库中没有的HCPs，并使用1D-LC的工作流程分析通过蛋白A亲和层析，阳离子交换层析和超滤纯化的IgG1单克隆抗体(mAb)。在纯化的mAb中添加0.5~100 ppm浓度的5种蛋白标准品来构建标准曲线(基于来自每种蛋白标准品的最高强度肽的3个最高强度片段离子的总峰面积建立校准曲线)。在纯化后mAb样品中鉴定并定量了16种HCPs。
(3) 稳定同位素标记iTRAQ
iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)实质上就是一种化学体外标记试剂，能够特异性标记蛋白质酶解产生的多肽[37-38]。对于定量蛋白质组学分析，使用稳定同位素标记iTRAQ，该方法能够在单次实验中同时进行8个样品的检测，并进行相对定量分析，LC-MS-iTRAQ可用于检测未去除高丰度蛋白的HCPs检测，iTRAQ试剂的昂贵价格，也限制了其常规使用。Lesley等[38]对收集的细胞上清、ProA纯化后样本、ProA纯化流穿液以及离子交换纯化前后样品进行8-plex iTRAQ分析，结果证明此方法适用于工艺过程中各阶段的HCPs检测。并发现被鉴定HCPs包括蛋白酶如组织蛋白酶和丝氨酸蛋白酶，这些蛋白酶之前已被证明在纯化后导致mAb降解[39-40]，硫氧蛋白还原酶可使细胞培养上清液中完整mAb被还原[41]。
(4) CZE-MS/MS
与RPLC相比，毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis，CZE)具有较小的进样量、较低的负载量和较低的浓度检测限。CZE近年来在蛋白质组学分析中受到越来越多的关注，这是由于灵敏而且稳定的CZE-MS接口与研究方法开发[42]，此外，与RPLC相比，CZE对于有限且珍贵的样品具有显著的优势。CZE-ESI-MS/MS系统由2个高压电源组成，CZE分离毛细管与质谱仪通过电动泵电喷雾连接。已有研究使用毛细管等电聚焦电泳(CIEF-MS/MS)和CZE-ESI-MS/MS来鉴定重组人源化mAb中的HCPs，并计算其绝对含量[42]。与大多数研究不同，样品用胰蛋白酶消化而不经过高丰度去除，将5个浓度水平的12种标准蛋白掺入重组mAb样品中，并使用CZE-MS/MS和RPLC-MS/MS分析。这2种方法都可以在100 ppm水平上检测到肽段。有实验表明，使用CZE上样50 ng鉴定出肽的数量与使用UPLC上样1 μg鉴定的肽段数量相似，而且用CZE-MS/MS分析从未去除高丰度蛋白样品中鉴定出24种蛋白质，而这24种蛋白在已经除去高丰度蛋白的样品中未检测出[42]，提示这24种蛋白可能与药物蛋白共流出而导致未检测到。
(5) LC-ESI-IM-MS/MS
液相色谱-电喷雾-离子淌度质谱(LC-ESI-IM-MS/MS)方法在常规RP-LC-MS/MS[18]基础之上使用新的电荷表面修饰(CSH)C18固定相来缓解HCPs分析中常见的色谱柱饱和度及峰拖尾的问题，共洗脱肽前体通过行波离子淌度(TWIM)来分离，通过调整前体碎裂的碰撞能量与迁移率漂移时间来提高低丰度HCPs肽的碎裂效率[43]。前体层面的离子淌度分离能够去除大量的干扰信号(包括重叠的碎片离子和噪声)，从而产生更少的叠加峰，更高能量的碎裂谱图，有助于正确识别序列。Catalin等[43]使用基于全面的二维液相色谱分离(RP/RP)与离子淌度高分辨率(~20 000)QTOF质谱相结合的改进方法，成功用于鉴定和定量低丰度HCPs。其在高纯度的mAb中检测(HCPs)杂质，方法的检测限可低至1 ppm。
2.2.6 方法对比以上每种方法都有其优缺点，本文对以上分析方法进行了归纳总结，详见表 2。
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表 2 各分析方法的对比总结表 Tab.2 Comparison summary table of analysis methods |
FDA最近推荐了一种针对生物技术产品的“QbD”方法[44]。QbD，即质量源于设计(Quality by Design，QbD)，是一套系统的、基于充分的科学知识和质量风险管理的研发方法，从预先确定的目标出发，强调对产品和工艺的理解以及工艺控制。
ICH(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)Q8中指出:产品的质量无法通过检验赋予，而是通过设计赋予的，认识这一点非常重要。ICH Q6A中强调了质量标准“Specifications”的角色:质量标准是一项重要的质量指征，它由生产商提出和论证，由管理机构批准并作为批准产品的依据。因此，其决定性作用的是生产商而非FDA的批准。这意味着药品从研发的开始阶段就要考虑最终产品的质量，包括处方设计和开发、生产工艺路线的选择和确定等。所以，基因工程药物的设计以及后续的质量控制每一步都要做风险评估，尤其是对CQAs的把控。已有对单克隆抗体HCPs及其他质控项风险评估的相关研究。
4 总结与展望近年来，基因工程药物对HCPs的关注度越来越高，对基因工程药物HCPs的认识也不断加深，从表达系统的选择、基因工程药物的性质、药物与HCPs的相互作用、培养周期、培养条件、细胞状态、细胞对剪切力的反应、纯化方法等多个方面对HCPs影响做了探索和研究。质谱等新的分析技术用于HCPs的检测与鉴定，会进一步指导对基因工程药物中HCPs的控制，从而提高生产效率，提高基因工程药物的质量，降低生产成本。进一步从QbD的角度提出HCPs控制策略。
随着高分辨质谱在生物制药行业的应用，不仅为生物制药行业鉴定了各种复杂分子的结构及特征，提高生产效率和质量，而且也存在问题，一方面专业的质谱设备、较高的人员素养要求、较高的设备维护费用等，使得一般企业生产成本提高；另一方面关于质谱等新技术的分析结论尚未达成共识。
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