洋葱伯克霍尔德菌复合体（Burkholderia cepacia complex，BCC）是一类表型近似，但在基因型上存在一定差异，环境中普遍存在的革兰氏阴性菌的总称^[1]。Yabuuchi等^[2]于1992年将假单胞菌属中隶属于系统发育系rRNA Ⅱ型的一些菌株重新分类为新的属，即伯克霍尔德菌属。20世纪90年代末，Vandamme等利用多相分类学，将伯克霍尔德菌复合体划分出至少5个不同的种（Burkholderia cepacia，Burkholderia multivorans，Burkholderiaceno cepacia，Burkholderia stabilis，Burkholderia vietnamiensis），并在其分类中引入基因型（Genomovar）的概念，借以指示在表型上无法区别，但基因水平存在差异的菌种^[3-4]。

由于在表型上的相似性，BCC无法通过传统的生理生化实验等表型特征进行鉴别区分，对于它们的分类学研究多基于基因水平，而BCC种间98%~100%的16S rRNA同源性为使得作为细菌分类鉴别“金标准”的16S rRNA序列分析方法在BCC的分类学研究上显得捉襟见肘^[5]。在BCC分类学的研究进程中，看家基因recA发挥了重要作用，recA基因编码蛋白参与DNA重组修复，在细菌基因组中普遍存在，高度保守，其序列分析多应用于遗传关系相近的物种^[6-7]。BCC种间recA基因的同源性则为94%~95%，而同一基因型（Genomovar）内部的同源性则达到98%~99%^[8]，弥补了16S rRNA对于BCC种间区分度不足的缺陷。基于recA基因的多态性分析，结合多相分类方法，更多的BCC新种被发现（Burkholderia dolosa，Burkholderia ambifaria，Burkholderia anthina，Burkholderia pyrrocinia）^[5]，而随着Burkholderia latens，Burkholderia diffusa，Burkholderia arboris，Burkholderia seminalis，Burkholderia metallica以及Burkholderia ubonensis^[9]的命名，recA基因的同源性分析及限制性片段长度多态性（RFLP）已成为BCC分类的主要研究手段。随着分子分型技术的进一步发展，近年来，对于BCC的分类研究拓展至其他看家基因，recA与多个保守基因联用的多位点序列分型（MLST）方法使得新的BCC成员得以被发现^[10]，除了较早定义的基因型Ⅰ~Ⅸ，被命名的BCC已超过20种^[11-17]。

虽然16S rRNA在BCC的分类鉴别中能力有限，但20世纪初，有研究者已开始研究核糖体分型技术对BCC的分型。其中，自动核糖体分型具有重复性好，耗时短等独特优势。2000年，Risse等^[18]通过对临床分离伯克霍尔德菌进行核糖体分型分析，发现其对Burkholderia gladioli，Burkholderia multivorans（GenomovarⅡ），及Burkholderia dolosa（Genomovar Ⅵ）的有效区分；2004年，该团队将法国临床分离的BCC菌株进行2种酶切（EcoRⅠ及PvuⅡ）获得的核糖体图谱进行分析，表明自动核糖体分型可对Burkholderia multivorans（GenomovarⅡ），Burkholderia cenocepacia（GenomovarⅢ），Burkholderia stabilis（Genomovar Ⅳ），Burkholderia vietnamiensis（GenomovarⅤ）及Burkholderia pyrrocinia（Genomovar Ⅸ）进行种间区分^[19]。这些研究表明核糖体自动分型在BCC鉴别分析及溯源中的应用前景。

本文研究对象为某外用样品中的分离菌株，来源批次不同，以及临床样本分离菌株。考虑到待分析样本量、时间等因素，在确认待检菌株为细菌的基础上，采用自动化核糖体分型技术对大量分离株进行准确的初筛分类，进而选取不同核糖体型的代表菌株，进行生化及16S rRNA序列分析，鉴别分析结果均指向洋葱伯克霍尔德菌复合体。如上所述，生化及16S rRNA序列分析对于BCC种间的区分能力有限，因此通过补充recA基因序列分析，将8株代表菌株准确区分至种水平，结合核糖体分型结果，对此次调查中的不同来源菌株完成了准确的鉴别及溯源分析，为污染事件的原因调查提供可靠依据。

1 材料及方法 1.1 菌株

产品编号1来源（某外用制剂批号1）菌株10株，分别为1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11；产品编号2来源（某外用制剂批号2）菌株8株，分别为2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8，样本来源3（临床）中分离得到菌株5株，分别为y-1、y-2、y-3、y-4、y-6。用于进化树分析的参考基因序列来自NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.2 核糖体分型（Ribotyping）

采用核糖体自动分型系统（Riboprinter，Hygiena，USA），按照仪器操作规范，使用EcoRⅠ酶切，大肠埃希菌（Escherichia coli）核糖体基因作为探针，对上述样本中分离的所有菌株进行自动分型。条带分析软件为BioNumerics，基于皮尔森相关系数（Pearson correlation coefficient），采用非加权配对算术平均法（unweighted pair group method with arithmetic averages，UPGMA）进行聚类分析，优化系数1.2%。

1.3 生化鉴定

采用Biolog Gen Ⅲ Microstation自动微生物鉴定系统，按照仪器操作规范，对上述菌株进行生化鉴定。

1.4 16S rRNA及recA基因扩增

上述菌株均划线于胰酪大豆胨固体培养基（TSA）上，置于32.5 ℃培养24 h。使用细菌基因组DNA提取试剂盒（Tiangen，DP302）提取基因组，进行目标序列扩增。16S rRNA引物27f：AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG；1492r：TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T。扩增条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，50 ℃引物退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。recA引物BCR1：TGA CCG CCG AGA AGA GCA A；BCR2：CTC TTC TTC GTC CAT CGC CTC^[8]。扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃引物退火45 s，72 ℃延伸2 min，32个循环；72 ℃延伸10 min。每25 μL反应体系中包括2×Taq Plus PCR MasterMix（Tiangen，KT205），上下游引物各0.2 μmol，模板10 ng。

1.5 序列测定及分析

PCR产物委托北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。序列比对分析通过BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）进行，利用MEGA 6.0进行遗传距离分析及系统发育树构建，采用邻间法，步值1 000。

2 结果分析 2.1 核糖体分型结果分析

基于皮尔森相关系数，使用UPGMA算法，样本分离菌株的核糖体分型及聚类结果如图 1，不同来源的菌株的核糖体型被聚类为3个不同的分组，分别是以样本1分离菌株及样本3分离菌株（4株）为代表的group 1，以样本3分离菌株y-1构成的group 2，以样本2分离菌株为代表的group 3。核糖体分型结果表明样本3中部分分离菌株与样本1分离菌株同源，暗示样本3的污染很可能来源于样本1。3组菌株在核糖体分型中的鉴别结果的SIM值均 < 0.85，但最高比对结果均指向洋葱伯克霍尔德菌，因此在鉴别分析水平上，上述3组菌株疑似为洋葱伯克霍尔德菌。利用核糖体分型的溯源优势，选取上述3组核糖体型中的代表菌株，进行后续鉴别分析。

2.2 生化鉴定结果分析

上述菌株生化鉴定结果如表 1所示。由表 1可知，待测8株菌株中5株在生化鉴定中无法确定其种水平归属，而2-1、2-2、2-3给出种水平鉴别结果，但与核糖体分型结果中，3株菌同属于group 3不符，这与文献报道中生化分析无法对BCC某些基因型进行准确区分一致。

2.3 16S rRNA序列分析结果

将所测实验菌株的16S rRNA序列置于NCBI进行BLAST，选取BCC中12个种代表菌株的16S rRNA序列与待测菌株16S rRNA序列构建邻间树，如图 2，上述菌株被聚类为两部分，待测菌株，基因型Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ代表菌株及不属于上述分类的Burkholderia contaminans、Burkholderia arboris归属至第一部分，同源性为99.2%~100%；基因型Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ的代表菌株被归属至第二部分，同源性为99.4%~99.5%，各基因型16Sr RNA同源性较高，无法明确区分。因此，除菌株y-1可明确归属至Burkholderi astabilis之外，其他菌株无法明确至种水平分类地位。显示步值> 50%结果，Burkholderia pseudomallei（ATCC23343）作为外群。

2.4 recA基因序列分析结果

对待测菌株及BCC中不同基因型代表菌株recA基因序列进行遗传距离及系统发育分析，如图 3。BCC中recA基因的种间同源性为93%~97%，各基因型能得到明确的区分，菌株1-1、1-2、1-3、y-2同源性达到100%，与Burkholderia cepacia ATCC25416同源性达99.3%，因此，可确定1-1、1-2、1-3、y-2菌株为Burkholderia cepacia；菌株2-1、2-2、2-3与Burkholderia cenocepacia（AF143784）同源性达99%，可确定此3株菌为Burkholderia cenocepacia；y-1与Burkholderia stabilis同源性达99.6%，可确定为Burkholderia stabilis，与16S rRNA分析结果一致。显示步值> 70%结果，Burkholderia pseudomallei作为外群。

3 讨论

在本实验中，涉及到的BCC种水平菌株包括Burkholderia cepacia（Genomovar Ⅰ），Burkholderia cenocepacia（Genomovar Ⅲ）以及Burkholderia stabilis（Genomovar Ⅳ），由前述研究可知，这几种基因型可通过核糖体分型进行区分，但由于数据库的限制，无法判断未知菌株的基因型，因此，无法给出可信的鉴定结果。即便如此，不同的种或者基因型并不会表现出相同的核糖体型，通过聚类将核糖体型一致或近似的菌株归属至同一分组，而后通过其他方法进一步对组内任一菌株进行鉴别分析，即可得知该组的种水平分类归属，这一优势也在本实验结果中得以体现。通过核糖体分型，临床分离的部分菌株与该外用制剂中的分离菌株核糖体型高度相似，第一时间快速地确定了污染来源，为问题调查节省了时间成本，也为后续进一步的实验结果提供了佐证。基于核糖体分型数据库的限制，后续也将尝试进行BCC本地数据库的扩增，以求使用核糖体分型方法即可完成对样品及环境中分离的疑似BCC菌株的初步鉴定和溯源分析，加快问题的分析及解决速度。

基于recA基因序列分析的研究方法经过近20年的发展，BCC特异性的recA扩增引物可以将疑似菌株定位在BCC范围内，并且根据扩增序列的同源性分析区分BCC中部分基因型，如本文所述。而作为对recA序列分析的补充，基于recA基因的RFLP方法已能够区分BCC种大多数的基因型^{[8, 20]}。MLST的应用使得已发现的所有BCC基因型均能被准确区分，并在BCC新种的发现中起到重要作用^[10]。针对BCC的MLST数据库也已建立（http://pubmlst.org/bcc/），为实验室之间的数据共享及互相验证提供平台。这一分型技术覆盖至目前已发现的所有BCC菌种，能够满足溯源鉴定中对疑似菌株更加精准的区分，以弥补某些BCC基因型无法利用单一保守序列分析方法获得准确结果的缺陷。由于本文中覆盖BCC菌种数量有限，后续将通过对BCC以及非BCC伯克霍尔德菌属微生物的MLST分型分析，进一步完善本文研究。

药品中分离微生物的鉴别和鉴定，根据目的可以选择不同的方法，常见的如生理生化、光谱、血清学、保守基因序列分析、PFGE及全基因组测序等。一般情况下，制药企业在水系统或样品中分离出疑似BCC时，应特别关注，通过风险评估采取适当措施。当中间产品或终产品出现疑似BCC污染、需要调查原因，或需要寻找污染源的时候，就需要对分离的疑似BCC进行准确鉴定至种水平甚至进行株水平的溯源分析。包括《中华人民共和国药典》在内的各国药典都规定了药品中不得检出的控制菌，例如金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、梭菌等。但是，对尚未列入药典规范的不可接受微生物的鉴定方法研究较少。本研究以污染了BCC的某外用制剂为例，采用了表型和基因型的方法，对3种来源的BCC进行了鉴定分析，其中生理生化和16S rRNA序列分析将疑似菌株归属至伯克霍尔德菌属或者BCC，对后续分析结果进行佐证；核糖体分型和recA序列同源性分析则完成对疑似菌株的分型及种水平鉴别，确定了污染菌及污染来源。无论是制药企业还是是检验机构，在遇到此类问题时，应结合实际情况及目的，根据需要选择1种或几种方法进行疑似BCC的鉴别和鉴定分析，将有利于问题的快速解决。