2019, Vol. 39 
2. 中国药科大学, 南京 210009
2. China Pharmaceutical University, Nanjing 21009, China
N-二甲基亚硝胺（N-dimethylnitrosamine，NDMA），又名N-亚硝基二甲胺，具有很强的肝脏毒性，世界卫生组织将其划分为2A类致癌物质[1-4]。近期在全球市场主流的降压药物缬沙坦中检出超量的NDMA，严重威胁患者的生命健康，全球20多个国家和地区紧急召回缬沙坦原料及制剂，成为全球关注的“缬沙坦事件”。
目前，NDMA的检测方法主要为气相色谱质谱法[5~9]、液相色谱法质谱法[10-11]、气相色谱热能分析仪法[12-13]，主要应用于食品、化妆品和烟草行业。国内外对药品中NDMA检测方法的研究报道较少[14-15]，本研究建立了利用气相色谱-热能分析仪法测定缬沙坦及其制剂中NDMA的方法，该方法前处理方法简单，专属性强，重复性好，灵敏度高。
1 仪器与试药Ellutia 800系列热能分析仪（Ellutia公司），INERTROAP-WAX（30 m×0.32 mm×0.5 μm）（岛津公司）；NDMA标准储备液溶液（100 μg·mL-1，AccusStandard公司）；甲醇（色谱纯，默克公司）；缬沙坦原料药4批（批号VST20180601、64617090604、0101220170804、C5356-17-037）、缬沙坦分散片（批号180302、180303、170303、36180520）、缬沙坦氢氯噻嗪分散片（批号180648、180649）、缬沙坦氢氯噻嗪胶囊（批号180524521、180525521）、市售缬沙坦氢氯噻嗪片（批号37180502）均购于药店。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱：INERTCAP-WAX（30 m×0.32 mm×0.5 μm）；进样口温度：220 ℃；进样方式：不分流进样；进样量：0.5 μL；载气：氮气（纯度 > 99.999%），流速为1.0 mL·min-1；程序升温：初温为60 ℃，保持2 min，以10 ℃·min-1升至120 ℃，保持1 min，以50 ℃·min-1升至200 ℃，保持2 min。
2.2 热能分析仪条件接口温度：250 ℃；热解室温度：500 ℃；真空度：59.85~66.5 Pa；氧气压力：13.79 kPa；臭氧水平：244（22.8 V）。
2.2 溶液制备 2.2.1 对照品溶液精密量取NDMA标准储备液溶液（100 μg·mL-1）适量，用甲醇稀释制成30 ng·mL-1的对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液原料药：精密称取缬沙坦原料1 g，置10 mL量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
制剂：精密称取缬沙坦制剂粉末2.5 g，用甲醇10 mL分2次提取，合并提取液置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得。
2.3 专属性分别精密量取空白辅料溶液、氢氯噻嗪溶液、甲醇及样品溶液各0.5 μL，按照“2.1”项下条件进样测定，记录色谱图（见图 1）。NDMA出峰时间约为6.4 min，相同保留时间处各溶液均无干扰峰。
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A.辅料（excipients）B.氢氯噻嗪（hydrochlorothiazide）C.甲醇（methanol）D.阳性样品（positive samples） 图 1 专属性试验色谱图 Fig.1 Chromatograms of method specificity tests for determination of NDMA |
精密量取NDMA标准储备液溶液（100 μg·mL-1）适量，用甲醇稀释制成10、20、30、50、100、200、500、1 000 ng·mL-1系列浓度的标准曲线溶液。进样检测，记录色谱图，以NDMA浓度（C，ng·mL-1）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归，得线性方程（n=8）：
A=12.61C+1.070 r=1.000
NDMA在浓度10~1 000 ng·mL-1范围内线性良好。
2.5 精密度精密量取30 ng·mL-1的线性试验用标准曲线溶液0.5 μL，注入GC-TEA，连续进样6次，记录色谱图，峰面积RSD为0.75%，表明仪器精密度良好。
2.6 重复性取含NDMA的样品（缬沙坦氢氯噻氢胶囊，批号180525521）适量，精密称定，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按照“2.1”项下条件进样测定，记录色谱图，按外标法计算，NDMA含量分别为0.060 5、0.061 1、0.059 8、0.060 8、0.059 4、0.061 2×10-6，RSD为1.2%，表明方法的重复性良好。
2.7 检测下限与定量下限精密量取10 ng·mL-1的线性试验用标准曲线溶液，稀释一定倍数，按信噪比3:1计算检测下限，信噪比10:1计算定量下限，结果仪器检测下限为3 ng·mL-1，定量下限为10 ng·mL-1。因此，按照“2.2.2”项下方法，NDMA的检出下限和定量下限在原料药中分别为0.03×10-6和0.1×10-6，在制剂中分别为0.012×10-6和0.04×10-6。
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图 2 检测下限（A）与定量下限（B）色谱图 Fig.2 Chromatograms of the LOD(A)and LOQ(B)tests for determination of NDMA |
取已知NDMA含量的样品（缬沙坦氢氯噻氢胶囊，批号180525521）适量，精密称取9份，分成3组，分别加入一定量的NDMA，加甲醇适量溶解，滤过，制得低、中、高3个不同浓度的回收率试验用供试品溶液。按照“2.1”项下条件进样测定，记录色谱图，按外标法计算NDMA含量见表 1。试验结果表明，3个不同浓度的回收良好。
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表 1 加样回收率试验结果 Tab.1 Results of recovery test |
供试品溶液室温保存于棕色进样瓶中，于0、6、12、24、48 h分别进样，峰面积RSD为1.8%，说明供试品溶液48 h稳定性良好。
2.10 样品检测取收集的13批次缬沙坦原料及制剂，按照“2.2.2”项制备供试品溶液，按照“2.1”项下条件进样测定，记录色谱图，外标法计算NDMA含量。样品测定结果见表 2，其中3批缬沙坦原料药、5批含缬沙坦制剂中NDMA含量范围为0.41~87.09×10-6，超过欧盟暂定限度（0.3×10-6）。
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表 2 样品测定结果 Tab.2 Results of sample determination |
热能分析仪能特异性催化裂解N-亚硝胺类化合物生成一氧化氮（NO）基团，再与臭氧反应后，利用光电倍增管检测产生的近红外光，是N-亚硝胺类化合物的特异性检测器。热能分析仪结合气相色谱仪对硝胺进行分析，具有高选择性和高灵敏度的特点。
3.2 前处理方法优选目前文献报道的NDMA测定方法主要应用于食品、烟草及化妆品，前处理过程一般需蒸馏提取、萃取净化、蒸发浓缩等过程，操作繁琐。本研究根据缬沙坦和NDMA在甲醇中均易溶解的特点，以甲醇为溶剂，无需净化直接进样分析，前处理简单、重复性好。
3.3 不同测定方法对比参考国家药典委员会《关于缬沙坦国家标准修订稿的公示》，采用GC-MS法检测缬沙坦中NDMA，定量离子为74，定性离子为43和42，结果显示GC-MS与GC-TEA 2种测定方法结果无显著性差异，但GC-MS法比GC-TEA特异性差，背景和基质干扰较多，定性定量离子保留时间附近有较多干扰色谱峰，影响低浓度样品的定性定量准确性。
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图 3 GC-MS提取离子图（m/z 74） Fig.3 Extraction chromatogram of the GC-MS for determination of NDMA |
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