2019, Vol. 39 
2. 苏州市药品检验检测研究中心, 苏州 215104
2. Suzhou Institute for Drug Control, Suzhou 215104, China
穿山甲来源于鲮鲤科动物中华穿山甲（Manis pentadactyla）的鳞甲，味咸，性微寒，入肝、胃经，具有通经下乳，活血消癥，消肿排脓，搜风通络的功效[1]。
炮山甲主要含有胆固醇、二十三酸丁胺、脂肪族酰胺等脂溶性成分以及氨基酸、蛋白等亲水性组分[2]。L-丝-L-酪环二肽、D-丝-L-酪环二肽是穿山甲中已知的2种环二肽[3]，L-甘-L-酪氨酸环二肽存在于美洲大蠊等药材中[4]。值得注意的是，中华穿山甲、马来穿山甲、印度穿山甲、树穿山甲经砂炒炮制后均产生大量丝-酪环二肽类成分，但在生品中含量却很低[5]。研究表明，环二肽类成分表现出了抗炎、抗肿瘤、抗凝、神经保护、免疫调节等多种显著的生物活性[6-7]。穿山甲中的L-丝-L-酪氨酸环二肽不仅能够提高小白鼠常压缺氧的耐受能力[2]，还具有活血化瘀的活性[8]。目前对穿山甲炮制后化学组成的研究大多集中于氨基酸组分、无机元素、溶出度等方面[9]，而关于其炮制后肽类成分的含量却鲜有报道[10]，仅有学者对穿山甲中L-丝-L-酪氨酸环二肽、D-丝-L-酪氨酸环二肽这2个成分的含量进行了测定[11]，但对其他环二肽类成分未作研究，另外前处理较为烦琐，易导致操作误差。2015年版《中华人民共和国药典》未收载穿山甲含量测定方法，为提高穿山甲质量标准，本文在前期对炮山甲化学成分提取、分离、鉴定的研究基础上，对炮山甲中含量较高的L-丝-L-酪氨酸环二肽、D-丝-L-酪氨酸环二肽以及首次从炮山甲中分离得到的L-甘-L-酪氨酸环二肽进行了含量测定研究，建立反相高效液相色谱同时3个成分的方法，方法经验证简便可行。同时考察了40批炮山甲饮片中3个成分的含量范围，为炮山甲的质量控制及应用提供了科学依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器赛默飞DGLC-3600 UltiMate® 3000高效液相色谱仪，DAD检测器，赛分Sepax Bio-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料为十八烷基硅烷键合硅胶）；梅特勒Mettler Toledo XS105DC电子天平（十万分之一），METTLER AE240电子天平（万分之一），赛默飞BIOFUGE primoR高速离心机；超纯水机水（Mill-pore）。
1.2 试药对照品L-丝-L-酪氨酸环二肽、D-丝-L-酪氨酸环二肽、L-甘-L-酪氨酸环二肽为本课题组自制，通过1H-NMR、13C-NMR、MS等手段确证其结构，HPLC法检测纯度 > 99%（面积归一法）。乙腈为色谱纯（Fisher公司），三氟乙酸（TFA）为色谱纯（格里斯公司），水为超纯水。经作者鉴定，样品9为印度穿山甲（Manis crassicaudata），样品10、14、16、25、29为树穿山甲（Manis tricuspis），其余样品为中华穿山甲（Manis pentadactyla Linnaeus）[5]，样品16、40为非法增重品[12]，见图 1。
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图 1 40批炮山甲样品图 Fig.1 40 samples of stir-baked pangolin scales |
精密称取L-丝-L-酪氨酸环二肽、D-丝-L-酪氨酸环二肽、L-甘-L-酪氨酸环二肽的对照品适量，加流动相配制得质量浓度分别为0.1122、0.1226、0.1174 mg·mL-1的混合溶液，即得。
2.1.2 供试品溶液取炮山甲样品粉末（过6号筛）约2 g，精密称定，置于锥形瓶中，加10倍量水回流提取30 min，放冷至室温，称量后用水补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液用微孔滤膜滤过，即得。
2.2 色谱条件采用赛分C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，以0.1%TFA乙腈-0.1%TFA水（2:98）为流动相，流速1.0 mL·min-1，检测波长210 nm，进样量10 μL。取“2.1”项下制得的溶液在上述色谱条件下测得的色谱图见图 2。
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1. L-丝-L-酪氨酸环二肽（cyclo-（L-Ser-L-Tyr））2. D-丝-L-酪氨酸环二肽（cyclo-D-Ser-L-Tyr）3. L-甘-L-酪氨酸环二肽（cyclo-（L-gly-L-Tyr）） 图 2 混合对照品（A）、1号样品（B）HPLC色谱图 Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and sample No.1(B) |
精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液0.5、1、2、5、10、15、20 μL，分别注入液相色谱仪进行测定，以峰面积Y对进样量X（μg）进行线性回归计算，回归方程、相关系数和线性范围结果见表 1。另取“2.1.1”项下混合对照品溶液逐级稀释，进样测定，当信噪比10:1时测得定量下限（LOQ），信噪比3:1时测得检测下限（LOD）。结果见表 1。
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表 1 3个成分的回归方程、线性范围、相关系数和检出下限、定量下限 Tab.1 Regression regressions, linear ranges, r, LODs and LOQs of 3 components |
精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，L-丝-L-酪氨酸环二肽、D-丝-L-酪氨酸环二肽、L-甘-L-酪氨酸环二肽峰面积RSD分别为0.55%、0.21%、0.44%。表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验取炮山甲粉末，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析，L-丝-L-酪氨酸环二肽、D-丝-L-酪氨酸环二肽、L-甘-L-酪氨酸环二肽峰面积RSD分别为0.61%、1.3%、0.53%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.3.4 重复性试验取同一批次的炮山甲粉末，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算L-丝-L-酪氨酸环二肽、D-丝-L-酪氨酸环二肽、L-甘-L-酪氨酸环二肽的平均含量分别为2.285、0.853 2、0.354 8 mg·g-1，RSD分别为0.92%、0.93%，2.3%。
2.3.5 加样回收试验精密称取已知含量的同一批炮山甲粉末6份，每份1 g，加入约与样品中待测成分含量等量的对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试溶液，按“2.2”项下色谱条件进样分析，计算回收率。结果L-丝-L-酪氨酸环二肽、D-丝-L-酪氨酸环二肽、L-甘-L-酪氨酸环二肽平均回收率分别101.8%、98.1%、95.7%，RSD分别为0.76%、2.2%、2.8%。
2.4 样品含量测定按“2.1.2”项下方法制备40批炮山甲样品的供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定，外标法计算3个成分的含量，每个样品平行3份，结果见表 2。L-丝-L-酪氨酸环二肽、D-丝-L-酪氨酸环二肽、L-甘-L-酪氨酸环二肽平均含量分别为0.13%、0.06%、0.04%，40批样品色谱图见图 3。
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表 2 40批炮山甲样品含量测定结果 Tab.2 Results of content determination of 40 samples |
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A. L-丝-L-酪氨酸环二肽（cyclo-（L-Ser-L-Tyr））B. D-丝-L-酪氨酸环二肽（cyclo-（D-Ser-L-Tyr））C. L-甘-L-酪氨酸环二肽（cyclo-（L-Gly-L-Tyr）） 图 3 40批穿山甲炮制品HPLC图谱 Fig.3 HPLC chromatograms of 40 batches of stir-baked pangolin scales |
使用SPSS 22.0软件对40批不同炮山甲样品的3个环二肽成分的含量进了系统聚类分析，采用组间连接法，采用Euclidean距离法进行计算[13]，结果见图 2。40批样品共为两大类，其中样品9为第2大类，其余39个样品为第1大类。随着阈值的减少，第1大类随着阈值的减小继续分为A、B两大类，三部分能够明显区分开，结果见图 4。
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图 4 环二肽类成分聚类分析 Fig.4 Cluster analysis of cyclic dipeptides |
应用DAD检测器在190~400 nm范围内对L-丝-L-酪氨酸环二肽、D-丝-L-酪氨酸环二肽、L-甘-L-酪氨酸环二肽进行光谱扫描，结果表明，在204 nm波长附近3个成分吸收系数均最大，干扰少且稳定，故选择210 nm作为检测波长，由于210 nm波长处甲醇会造成干扰，故本实验选择含0.1%TFA的水和乙腈作为流动相。
3.2 供试品溶液制备方法的考察考察了超声提取法和回流提取法对L-丝-L-酪氨酸环二肽、D-丝-L-酪氨酸环二肽、L-甘-L-酪氨酸环二肽含量测定的影响。结果显示，回流提取法提取更完全。提取溶剂考察了水、甲醇溶液（25%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、75%甲醇水溶液、甲醇），乙醇溶液（25%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液、75%乙醇水溶液、乙醇）。结果显示，采用水溶液提取时，L-丝-L-酪氨酸环二肽、D-丝-L-酪氨酸环二肽、L-甘-L-酪氨酸环二肽含量均较高，且L-丝-L-酪氨酸环二肽、D-丝-L-酪氨酸环二肽、L-甘-L-酪氨酸环二肽不易溶于甲醇、乙醇。考察了提取时间为0.5、1、2 h时的提取效果。结果含量相近，因此选择0.5 h作为提取时间。
4 结论本实验对40批炮山甲样品中L-丝-L-酪氨酸环二肽、D-丝-L-酪氨酸环二肽、L-甘-L-酪氨酸环二肽成分的含量进行测定，通过含量测定及聚类分析结果可以看出，不同批次的炮山甲均含有上述3个成分，但各样品含量差异较大。多数样品中L-丝-L-酪氨酸环二肽的含量最高，少数样品如9号（印度穿山甲）、10号（树穿山甲）、14号（树穿山甲）、39号（中华穿山甲）的L-甘-L-酪氨酸环二肽含量最高；样品中环二肽含量的差异与不同来源穿山甲的相关性不明显。但是，盐类增重的16号及40号样品被分在1组，且环二肽含量较低，说明盐类增重对炮山甲中的环二肽含量影响较大，会影响环二肽的稳定性。炮山甲中环二肽含量可能与来源、加工、环境等因素有一定的联系，都可能在一定程度上影响环二肽的含量，本研究可为穿山甲相关成分的进一步研究提供参考依据。
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