近年来，随着免疫抑制治疗、化疗、实体器官移植的增多，中心静脉置管术以及心脏人工瓣膜植入术等介入性治疗的开展，发生侵袭性真菌感染（invasive fungal infection，IFI）的患者人数逐年上升。伏立康唑是对氟康唑进行结构改造后合成的新型三唑类药物，属于第Ⅱ代三唑类广谱抗真菌药，伏立康唑主要对侵袭性曲霉菌、耐氟康唑侵袭性念珠菌属、足放线病菌属和镰刀菌属有很好的抗菌活性^[1]，是治疗侵袭性曲霉病的首选药物^[2]。伏立康唑体内代谢呈非线性药代动力学，并且受CYP酶系的2C19、3A4、2C9等的基因多态性影响，使伏立康唑血药浓度个体差异较大^[3-6]。临床上经该酶系代谢的药物较多，联合用药对血药浓度影响较多。因此，建议进行伏立康唑的临床治疗药物监测，以便及时调整给药方案，实现个体化用药。本文采用二维高效液相色谱建立测定伏立康唑血药浓度的方法，已成功对79名肾移植受者进行了280次监测，并对监测结果进行初步评析。

1 材料 1.1 仪器

FLC 2420 2D-LC-UV系统由全自动二维液相色谱耦合仪（湖南德米特仪器有限公司）及岛津液相色谱LC-20AT部件构成；GH-202万分之一电子分析天平（AND公司）；TDZ4-WS低速离心机（湖南湘仪公司）；Mini-15K微型高速离心机（杭州奥盛公司），XW-80A旋涡混合器（上海琪特公司）；医用冰箱（合肥美菱公司）。

1.2 药品与试剂

伏立康唑对照品（批号100862-201402，含量99.7 %，中国食品药品检定研究院）；VCV-1D移动相、OPI-1有机移动相、BPI-1碱性流动相、MPI-1流动相、ACP-1去蛋白剂、ACG保护剂（均购于湖南德米特仪器有限公司）；纯净水为怡宝纯净水；空白马血清（购于北京政博伟业生物科技有限公司）。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

第一维色谱系统中，采用Aston SC2色谱柱（4.6 mm×25 mm，5 μm），流动相为VCV-1D移动相，流速0.7 mL·min^-1；采用Aston SH转移柱（3.0 mm×10 mm，5 μm），流动相为纯水。第二维色谱系统中，采用Aston SCB（4.6 mm×100 mm，5 μm）色谱柱，流动相为OPI-1有机移动相-BPI-1碱性移动相-MPI-1移动相（30:48:22），流速1.0 mL·min^-1。柱温40 ℃，紫外检测波长262 nm，采用等度洗脱，进样量200 μL。

本实验时间程序：0~1.89 min完成样品进样和第一维色谱分离；1.90~2.85 min目标物转移至中间柱；2.86~4.20 min目标物转移至二维色谱；4.21~ 10.00 min目标物在第二维色谱中完成分离。

2.2 对照品溶液的配制

称取伏立康唑对照品6.00 mg，用25%异丙醇水溶液溶解并定容至50 mL得药物母液，质量浓度为120 μg·mL^-1，置-20 ℃冰箱中保存，备用。

2.3 质控品的配制

量取“2.2”项下对照品溶液0.5 mL，置于10 mL量瓶中，用空白马血清定容至刻度，得高浓度质控品（6 μg·mL^-1）。依次配得中浓度质控品（3.6 μg·mL^-1）、低浓度质控品（1.2 μg·mL^-1）。质控品置于-20 ℃冰箱备用。

2.4 样品处理及测定

血液样品低速离心（3 000 r·min^-1）5 min，准确吸取上层血清300 μL至1.5 mL EP管中，再准确吸取ACP-1去蛋白剂900 μL至EP管中，EP管涡旋振荡1 min后，高速离心（14 500 r·min^-1）8 min，取1 000 μL上清液至1.5 mL进样瓶中，再准确吸取ACG保护剂100 μL，震荡摇匀，备用。在“2.1”项色谱条件下，进样200 μL，记录色谱图和峰面积，采用外标工作曲线法定量，将样品峰面积代入标准曲线，计算所得浓度。每次样品测定随行测1个质控品，以保证结果的准确可靠。

2.5 色谱行为和专属性

在上述“2.1”项色谱条件下，分别对空白血清、中浓度质控品（3.6 μg·mL^-1）以及服药患者样本（患者服药期间，在下次给药前30 min内抽取静脉血，离心得血清样本）按“2.3”项下处理，按“2.1”色谱条件进行测定，色谱图见图 1，血清内源性物质及其它杂质均不干扰样品的分离测定。

2.6 标准曲线及检测下限

用空白马血清将伏立康唑对照品溶液稀释成系列浓度溶液（0.38、0.75、1.5、3、6、12 μg·mL^-1），按“2.4”项下方法处理并测定，以质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程：

$ Y=8.991 \times 10^{4} X-1.332 \times 10^{4} \quad r=0.9999 $

参考美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）相关指南，所选线性范围（0.38~12 μg·mL^-1）包含其治疗浓度参考范围和实验室危急值，满足临床测定范围的要求。

2.7 回收率和精密度

取“2.3”项下高、中、低质控品，每个浓度设置6组平行，按“2.4”项方法进行处理并测定，同日进样，计算回收率和日内精密度；每个浓度每天设置5个平行测定，取平均值，连续测定5d，考察方法日间精密度，结果见表 1。

由表 2结果可知，本研究建立的伏立康唑分析方法的回收率高于95%，日内、日间的精密度RSD均小于5%。该分析方法测定准确，重复性好，符合生物样品分析的要求^[7]。

2.8 样品稳定性

取“2.3”项下高、中、低质控品，按“2.4”项下方法处理并测定，分别考察室温放置24 h、反复冻融3次以及-20 ℃冰冻保存30 d的测试样品，结果见表 2。结果表明血清中伏立康唑稳定性良好，RSD均小于5%。

2.9 临床应用

2017年6月—2018年6月期间，对肾移植科79名住院患者进行伏立康唑血药浓度监测，共280例。参考《中国实体器官移植受者侵袭性真菌病临床诊治指南（2016版）》^[8-9]中推荐监测伏立康唑血浆浓度保持在2~4 μg·mL^-1，依据此推荐对纳入的280例监测结果进行评析。154例结果小于2μg·mL^-1，占总样本量的55.0%；97例在推荐治疗窗（2~4 μg·mL^-1）之内，占总样本量的34.6%；29例结果高于4 μg·mL^-1，占总样本量的10.4%。以上结果分析，在肾移植科伏立康唑整体使用量不足，达到有效治疗浓度者仅有1/3，临床上应予以重视，临床药师可根据治疗药物监测（TDM）结果更密切地参与伏立康唑临床用药，监测伏立康唑血药浓度对促进合理用药十分必要。

3 讨论

本研究所用全自动二维液相色谱系统与常规二维液相色谱不同^[10-15]，该二维液相色谱运用自动化的中间柱作为转移接口，中间色谱柱不仅承担了捕获与转移功能，还承担拦截功能，使目标物从共洗脱物中得以分离；在该二维液相色谱柱体系中，中间柱的特异性拦截和透过性能，可以实现多种化学结构不同的药物共柱体系测定。日常工作中，每日随机抽取1份质控品与样品随行检测，一旦发生质控偏离情况，可通过检查LC2条件对照品色谱图，校验LC1窗口状态以及观察中间柱的捕获、洗脱效果等一系列措施进行失控回溯，这是目前其他二维液相色谱无法比拟的，在长期的质量控制及运行过程中具有非常重要的意义。与其他二维液相色谱系统相比，该系统具有明显优势，样品前处理简单易行；样品测定完成后色谱柱无需清洗；流动相由于事先进行了灭菌和密封处理，可以长期放置，无需每日配置；系统采用热量智能补充技术，色谱柱通常15 min可以平衡完毕。这些技术大大节省仪器准备和维护时间，增加TDM的实时性能力。

方法学验证结果显示，回收率 > 95%。在0.38~ 12 μg·mL^-1内，具有良好的线性关系（r=0.999 9），精密度及稳定性试验均符合要求。280例临床血样监测结果，278例均在标准曲线范围内，仅有2例低于0.38 μg·mL^-1，查明原因，为患者忘记服药所致。本研究建立的全自动二维液相色谱测定伏立康唑血药浓度的方法，具有前处理简单，测定快速，灵敏度高，准确性好，稳定性强等特点，能满足临床报告及时性、准确性和测定范围等要求，可以作为临床治疗药物浓度监测的有效方法。