2019, Vol. 39 
2. 内蒙古林业总医院, 牙克石 022150
2. Inner Mongolia Forestry General Hospital, Yakeshi 022150, China
野艾蒿是一种多年生菊科蒿属草本植物，在我国内蒙古、甘肃等地分布密集，与艾草同作为“艾”类药物，具有散寒祛湿、温经止血等多种活性[1]。黄酮类化合物属于植物次级代谢产物，在菊科、豆科、唇形科中含量丰富[2]。诸多研究证实，黄酮类化合物能够有效降低血浆中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平，对高脂血症及心脑血管疾病的防治具有一定效果[3]。在真核生物体内各类细胞的生理、生化代谢过程中黄酮类化合物也因其独特的化学结构和反应性，起到了至关重要的调节作用[4]。相关研究发现，以野艾蒿茎、叶入药制成的蒙药童格勒格-1对大鼠高脂模型降脂作用明显[5]；而野艾蒿乙酸乙酯提取部位可以明显升高大鼠肝细胞中低密度脂蛋白受体的表达[6]。由此可见，探寻天然中草药资源有效成分的调脂功能对于今后新型降脂类药物的研发和作用机制的确立具有重大意义。
腺苷酸蛋白活化激酶（adenosine monophosphate- activated protein kinase，AMPK）作为广泛存在于真核生物体内一类保守的寡聚蛋白，被称为“细胞的能量感受器”[7]。在受到相关刺激激活后，可以关闭糖原、脂肪酸等物质合成代谢途径的同时，开启葡萄糖利用、糖酵解等分解代谢途径以此维持机体能量代谢平衡。这一特性也使得AMPK在防治代谢性疾病等方面具有广阔的研究前景。一磷酸腺苷/三磷酸腺苷（adenosine monophosphate/ adenosine triphosphate，AMP/ATP）含量比值变化和上游钙调蛋白依赖性激酶（Ca2+ dependent protein kinase kinase，CaMKK）调节是AMPK活化的2条重要途径[8]。当机体能量供应不足时，一方面AMP大量积累导致AMP/ATP比值升高，从而磷酸化AMPKα亚基上的苏氨酸-172（Threonine-172，Thr-172）位点激活AMPK[9]；另一方面AMP还可以通过竞争性地结合AMPKγ亚基，同样达到激活目的[10]。CaMKK可分为CaMKKα和CaMKKβ2种亚型。早期研究表明，CaMKKβ的活性可因Ca2+浓度的变化而发生改变[11]。在Hela细胞中，当Ca2+浓度升高时CaMKKβ活性随之增强，AMPK也在受到该刺激后激活，而这一过程主要是通过磷酸化AMPKα亚基上的Thr-172位点得以实现的[12]。体外实验同样证实，单独提取出的CaMKKβ能够磷酸化AMPKα亚基上的Thr-172位点而不依赖于其他协同或辅助效应[13]。因此，CaMKK只是通过感受细胞内Ca2+浓度的变化来调节AMPK活性与AMP/ATP含量比值的变化并无联系[14]。活化后的AMPK能够进一步使其下游靶蛋白ACC——脂肪酸合成过程中的关键酶活性降低，从而调节脂质代谢[15]。
课题组前期提取500 g野艾蒿干品得到总黄酮类化合物15.4 g，紫外分光光度法测得样品中总黄酮含量为44.56 mg·g-1；细胞毒性实验结果显示，野艾蒿总黄酮能够一定程度上抑制HepG2细胞增殖且随着时间推移和浓度升高此效果愈发明显，根据实验结果筛选（药物对细胞抑制率在15%~20%之间）选定24 h、0.010 mg·mL-1为后续最适实验条件[16-17]。本次实验在此结果基础之上，采用Western blot和超高效液相色谱法从分子水平上揭示野艾蒿总黄酮、AMPK、ACC三者之间的脂质代谢调节通路以及野艾蒿总黄酮是否通过CaMKK和AMP/ATP这2条途径来达到激活AMPK蛋白的目的。
1 仪器与试剂 1.1 仪器PRACTUM5101-1CN 0.1 mg电子天平（Sartorius公司）、Form 301 CO2培养箱（Thermo Fisher公司）、Micro 2/R高速低温离心机（Thermo scientifi公司）、UltiMate 3000高效液相色谱仪（Fisher公司）、TE 2000倒置显微镜（Nikon公司）、Chemi DOC×RS+凝胶成像系统（Bio-Rad Laboratories）。
1.2 试剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸（5-aminoimi-dazole-4-carboxamide ribofuranoside，AICAR，纯度 > 98%）、Compound C（纯度 > 99%）购自Abcam公司；DMEM高糖培养液、油红0染色液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶制备试剂盒、5×蛋白上样缓冲液、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS 0.01 mol·L-1）、等渗缓冲盐溶液（Tris buffer saline and Tween-20，TBST含0.5% Tween-20）、牛血清白蛋白（纯度≥98%）、蛋白定量试剂盒、ECL超敏发光液购自北京索莱宝生物科技公司；细胞裂解液、蛋白酶抑制剂购自碧云天生物科技公司；STO-609钙调蛋白特异性抑制剂（纯度 > 95%，HPLC检测）、ATP对照品、AMP对照品、ADP对照品购自Sigma公司；色谱级甲醇和其他分析纯试剂购自天津福晨化学试剂厂；油酸（分析纯）购自天津致远化学试剂厂；脱脂奶粉购自BBI生命科学公司；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）购自Roche公司。
1.3 细胞株人肝癌细胞HepG2（受赠于内蒙古医科大学生物研究中心苏丽娅教授）。
1.4 材料植物标本由内蒙古自治区包头市中蒙医院赵树忠主任药师提供，经内蒙古科技大学包头医学院蒙中医药研究中心李旻辉教授鉴定为菊科蒿属多年生草本植物野艾蒿（Artemisia lavandulaefolia DC.）全草。
2 方法 2.1 HepG2细胞脂质堆积模型的建立及油红0染色观察药物对HepG2细胞脂代谢的影响取生长状态良好的HepG2细胞接种于6孔板中，待细胞铺满孔板底部90%以上时加入100 µmol·L-1油酸刺激细胞24 h制备脂质堆积模型[18]。6孔板细胞分为对照组（只加细胞），实验1~3组（野艾蒿总黄酮给药质量浓度分别为0.100、0.010和0.001 mg·mL-1），AMPK激动剂组（AICAR 1 mmol·L-1），AMPK抑制剂组（Compound C 40 µmol·L-1作用30 min后加入野艾蒿总黄酮0.010 mg·mL-1）37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养。24 h后弃去各组细胞液4%多聚甲醛4 ℃冰箱固定过夜，作用时间结束时1×PBS清洗1次。各孔加入油红染色液5 g·L-1，常温作用15 min，再以1×PBS清洗2次，倒置显微镜下观察。
2.2 Western blot检测药物作用后HepG2细胞脂质堆积模型中ACC磷酸化表达按照“2.1”项下的方法建立HepG2细胞脂堆积模型并分组培养细胞至“37℃、5%CO2培养箱中，继续培养24 h后弃去各组细胞液”，每孔加入200 µL细胞裂解液和蛋白酶抑制剂冰上作用15 min，12 000 r·min-1、4 ℃离心10 min所得上清液即细胞总蛋白样品，使用蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。将提取出的蛋白样品与上样缓冲液经水煮沸5 min变性，每孔20 µL加样，经10%聚丙烯凝胶电泳分离、转膜至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉封闭60 min。封闭液稀释一抗ACC（1:1 000）、p-ACC（1:1 000）、β-actin（1:1 000）4 ℃过夜。一抗孵育结束后TBST清洗3次，封闭液稀释辣根过氧化物标记山羊抗兔二抗（1:4 000）37 ℃避光2 h。二抗孵育结束后TBST清洗3次，取ECL超敏发光液[A液-B液（1:1）]室温平衡15 min，避光显色5 min。BIO-RAD凝胶成像系统分析结果。
2.3 高效液相色谱检测野艾蒿总黄酮激活AMPK对细胞内AMP/ATP水平的影响常规培养HepG2细胞于培养皿中，待生长至铺满皿底85%~90%时加入0.02%牛血清白蛋白孵育过夜。细胞分为对照组（只加细胞），药物1~3组（野艾蒿总黄酮给药质量浓度为0.100、0.010和0.001 mg·mL-1），AMPK激动剂组（AICAR 1 mmol·L-1）37 ℃、5%CO2培养6 h。作用时间结束后收集细胞，1 200 r·min-1离心5 min弃上清，沉淀中加入150 µL高氯酸（4%，v/v），冰上作用30 min；2 mol·L-1氢氧化钾溶液调节pH至6~8后再次冰上作用30 min，13 000 r·min-1、4 ℃离心10 min，收集上清即得待测溶液。取ATP、AMP、ADP对照品各1 mg装入10 mL量瓶中，超纯水定容，即得混标溶液。吸取200 µL混标溶液上机检测，记录ATP、ADP、AMP峰出现时间及峰面积。0.25 µm滤膜过滤待测溶液2次，吸取200 µL待测溶液上机检测，记录各对照品出峰时间下待测样品相应峰面积，通过待测样品与对照品两者峰面积计算出待测样品中ATP、AMP、ADP的含量及AMP/ATP含量的变化。
采用UPLC HSS T3 C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.8 µm），以流动相A（0.1%磷酸盐溶液）和流动相B（甲醇）进行梯度洗脱分离。洗脱过程及条件：0~2 min，99%A；2~7 min，99%A→89%A；7~15 min，89%A；15~18 min，89%A→99%A；18~20 min，99%A。流速0.25 mL·min-1。柱温25 ℃。进样体积10 µL。检测波长254 nm。
2.4 Western blot检测CaMKK失活对野艾蒿总黄酮激活细胞内AMPK的影响常规培养HepG2细胞于培养皿中，待生长至铺满皿底85%~90%时加入0.02%牛血清白蛋白孵育过夜。细胞分为对照组（只加细胞）、药物组（野艾蒿总黄酮0.010 mg·mL-1）、AMPK抑制剂组1（STO-609 10 mg·L-1作用30 min后加入野艾蒿总黄酮0.010 mg·mL-1）、AMPK抑制剂组2（Compound C 40 μmol·L-1和STO-609 10 mg·L-1共同作用30 min，加入野艾蒿总黄酮0.010 mg·mL-1）37 ℃、5%CO2培养箱中培养6 h。按照“2.2”项下的Western blot检测过程操作并得出结果。
2.5 统计学分析处理实验数据采用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料用（χ±S）表示，组间比较采用配对t检验分析，以P < 0.05为有统计学意义。
3 结果 3.1 野艾蒿总黄酮能够通过AMPK靶点促进HepG2细胞脂质代谢正常状态下的HepG2细胞呈细长梭形，排列紧密，边缘清楚，贴壁生长（图 1-a）。加入100 µmol·L-1油酸刺激24 h后细胞出现固缩变圆、边缘粗糙，间隙明显等现象（图 1-b）。经油红染色后能够看到存在于细胞内被染为红色的脂肪颗粒（图 1-c）。AMPK激动剂组和各实验组在分别加入AICAR以及野艾蒿总黄酮后均能够看到红色脂肪颗粒不同程度上的减少（图 1-d~g），其中0.010 mg·mL-1药物与AMPK激动剂降脂效果明显。0.100 mg·mL-1和0.001 mg·mL-1药物虽同样具有降脂能力，但与0.010 mg·mL-1药物和AMPK激动剂相比效果较差。AMPK抑制剂组经Compound C作用后加入最适浓度药物，红色脂滴颗粒仍大量存在于细胞内，与油红模型组相比变化不大（图 1-h）。实验结果可以看出，野艾蒿总黄酮正是通过AMPK这一靶点来促进HepG2细胞脂代谢的。
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a.正常HepG2细胞（normal HepG2 cells）b.油酸模型组（oleic acid model group）c.油红染色模型组（oil red staining model group）d. 0.100 mg·mL-1野艾蒿总黄酮组（0.100 mg·mL-1 total flavonoids from Artemisia lavandulaefolia group）e. 0.010 mg·mL-1野艾蒿总黄酮组（0.010 mg·mL-1 total flavonoids from Artemisia lavandulaefolia group）f. 0.001 mg·mL-1野艾蒿总黄酮组（0.001 mg·mL-1 total flavonoids from Artemisia lavandulaefolia group）g. AMPK激动剂组（AMPK agonist group）h. AMPK抑制剂组（AMPK inhibitor group） 图 1 不同浓度野艾蒿总黄酮作用HepG2细胞24h后镜下细胞形态（×100） Fig.1 Microscopic morphology of HepG2 cells treated with different concentrations of total flavonoids from Artemisia lavandulaefolia for 24 hours (×100) |
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图 2 野艾蒿总黄酮对HepG2细胞中ACC蛋白磷酸化表达的影响（χ±S，与对照组相比，***P < 0.001，**P < 0.01） Fig.2 Effects of total flavonoids from Artemisia lavandulaefolia on the expression of ACC protein phosphorylation in HepG2 cells(χ±S, compared with control group, ***P < 0.001, **P < 0.01) |
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图 3 CaMKK抑制剂对野艾蒿总黄酮上调HepG2细胞AMPK蛋白磷酸化表达的影响（χ±S，与对照组相比，***P < 0.001） Fig.3 Effects of CaMKK inhibitor on up-regulation of AMPK protein phosphorylation in HepG2 cells by total flavonoids of Artemisia lavandulaefolia(χ±S, compared with control group, ***P < 0.001) |
Western blot结果显示，AMPK激动剂和不同浓度药物均可上调ACC蛋白的磷酸化表达（与对照组相比，P < 0.05）药物质量浓度为0.010 mg·mL-1时效果显著。AMPK抑制剂组经Compound C处理后ACC蛋白的磷酸化表达处于较低水平，与对照组相比差异无统计学意义（与对照组相比，P > 0.05）药物诱导的激活效果几乎被完全阻断。
3.3 野艾蒿总黄酮激活细胞内AMPK时并未受到CaMKK活性的影响Western blot结果显示，0.010 mg·mL-1药物能够有效上调HepG2细胞内AMPK蛋白的磷酸化表达（与对照组相比，P < 0.05）。当加入CaMKK特异性抑制剂STO-609（AMPK抑制剂组1）后AMPK蛋白仍然处于较高的磷酸化表达水平，并未出现明显变化（与药物组相比，P > 0.05）。在继续加入AMPK抑制剂Compound C（AMPK抑制剂组2）后AMPK蛋白的磷酸化表达受到显著抑制（与对照组相比，P > 0.05）。可以看出，野艾蒿总黄酮激活AMPK时与上游激酶CaMKK的活性并无关联。
3.4 野艾蒿总黄酮激活细胞内AMPK时并不依赖于AMP/ATP比值的变化高效液相色谱（见图 4-A~E）显示，在分别加入不同浓度药物以及AMPK激动剂后，HepG2细胞中的ATP、AMP、ADP含量和AMP/ATP比值未发生明显改变（见图 5~6），各药物组、AMPK激动剂组与对照组相比差异均无统计学意义（P > 0.05）。说明野艾蒿总黄酮激活AMPK时并不影响细胞内AMP/ATP水平。
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图 4 ATP、AMP、ADP标准品（A）、0.100mg·mL-1野艾蒿总黄酮组（B）、0.010mg·mL-1野艾蒿总黄酮组（C）、0.001mg·mL-1野艾蒿总黄酮组（D）和AMPK激动剂组（E）色谱图 Fig.4 Chromatograms of ATP, AMP and ADP standards (A), group of 0.100 mg·mL-1 total flavonoids of Artemisia lavandulaefolia (B), group of 0.010 mg·mL-1 total flavonoids of Artemisia lavandulaefolia(C), group of 0.001 mg·mL-1 total flavonoids of Artemisia lavandulaefolia(D)and AMPK agonist group(E) |
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图 5 野艾蒿总黄酮对HepG2细胞中ATP、ADP、AMP含量的影响（χ±S） Fig.5 Effects of total flavonoids from Artemisia lavandulaefolia on the contents of ATP, ADP and AMP in HepG2 cells(χ±S) |
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图 6 野艾蒿总黄酮对HepG2细胞中AMP/ATP比值的影响（χ±S） Fig.6 Effect of total flavonoids from Artemisia lavandulaefolia on AMP/ATP ratio in HepG2 cells(χ±S) |
我国幅员辽阔，天然药物资源丰富，包括野艾蒿、银杏叶、决明子在内的许多传统中草药在防治代谢异常疾病方面都具有各自独特的作用机制[19]，这些植物药用成分可能存在着和当今临床常用药物不同的靶点和通路。本实验以我国传统中草药野艾蒿中的总黄酮类化合物作为研究对象，探索其调节HepG2细胞脂质代谢通路及激活AMPK过程中可能存在的途径。结果显示，野艾蒿总黄酮能够有效激活HepG2细胞中的AMPK蛋白并磷酸化其下游靶点ACC，而ACC活性降低则会直接影响细胞内的脂质合成，从而证实了“药物—AMPK—ACC”这一调脂通路的存在。另一方面，野艾蒿总黄酮在激活HepG2细胞内的AMPK蛋白过程中并未受到上游激酶CaMKK活性的调节以及改变细胞内AMP/ATP水平，说明在此活化过程中存在着与这2条AMPK激活途径所不同的其他信号通路。但AMPK上游存在着多种激活因子，如白细胞介素6、肿瘤坏死因子等[20]。因此，野艾蒿总黄酮是否通过激活AMPK上游激活因子从而间接活化AMPK，亦或是通过比AMP/ATP、CaMKK这2条AMPK激活途径更加灵敏、特异的其他信号通路来达到活化AMPK的目的仍需要进一步研究。
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