2019, Vol. 39 
2. 南昌大学公共卫生学院, 南昌 330000
2. School of Public Health Nanchang University, Nanchang 330000, China
大豆苷元（DA1）是大豆中的一类次生代谢产物，近年来研究表明，DA1具有抗动脉粥样硬化，预防癌症，预防心血管疾病，降血糖，抗氧化，减轻妇女更年期综合症，抗衰老等重要生理功能[1-5]，但DA1含有2个极性基团羟基，分子间形成氢键，亲脂亲水性均较差。DA1进入体内被迅速吸收并代谢而失活。本课题组以DA1为先导物，根据药动团变换原理，以改善其药学性质的目的进行修饰，合成苯磺酸酯类衍生物，希望结构上的改变可以从根本上改善其药学性质，增加其生物活性[6-9]。
由于传统加热法在衍生物大豆苷元-7-苯磺酸酯（D2）上引入烷基十分困难，为提高目标衍生物的产率，采用微波加热法合成大豆苷元-4′-甲氧基-7-苯磺酸酯（D3）和大豆苷元-4′-乙氧基-7-苯磺酸酯（D4），并D3和D4进行药学性质研究。利用HPLC测试药物的溶解度和表观脂水分配系数（lgP），以及利用药物设计软件ChemAxon16.1.18对DA1及衍生物的lgP、分子极性表面积、分子可极化率、分子摩尔折射率、氢键和解离常数（pKa）等性质进行计算。利用HPLC考察DA1及D3、D4的人主动脉血管平滑肌细胞（HAVSMCs）的吸收利用率。综合实验结果对D3、D4的药物代谢性质和活性进行预测，并初步讨论构性关系。合成路线见图 1。
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图 1 DA1衍生物D3和D4的合成 Fig.1 Synthesis of DA1 derivatives D3 and D4 |
WRR型数字显示显微熔点仪（北京泰克仪器有限公司），温度计未经校正。THZ-22台式恒温振荡器（江苏太仓实验仪器设备厂），XH-MC-1型祥鹄实验室微波合成反应仪。药物计算软件ChemAxon16.1.18。Agilent 1260 HPLC[Agilent 1260自动进样器（G7129A），EC-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）]，TG18-WS型湘立台式高速离心机，Hair超低温冰箱，DN-24A型氮吹仪，美国ESCO二氧化碳培养箱，日本Olympus倒置生物相差显微境。
DA1纯度 > 98%，购于陕西慧科植物开发有限公司；青霉素链霉素混合液购自Solarbio，生物级二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma；南美胎牛血清（No：11G327）购自Excell，DMEM高糖培养基（No：AD16191265）购自Hyclone。HVSMCs购自北纳创联生物技术有限公司。其余试剂为化学纯或分析纯。
2 大豆苷元苯磺酸酯的微波合成 2.1 D3的微波合成66 ℃时，于100 mL烧瓶中加入D2 0.358 6 g，丙酮20 mL，再加入碳酸钾0.629 5 g溶于反应液，在剧烈搅拌下加入硫酸二甲酯1.24 mL，微波功率300 W，回流反应55 min，薄层层析（TLC）检测反应完成后，抽滤得初产品，柱层析纯化流动相为二氯甲烷-丙酮（20:1），得白色固体0.2674 g，产率72%。
2.2 D4的微波合成58 ℃时，于100 mL烧瓶中加入D2 0.729 8 g，丙酮32 mL，再加入由氢氧化钾0.216 8 g溶于0.8 mL水配成的溶液，10 min内在剧烈搅拌下滴加硫酸二乙酯0.9 mL的丙酮18 mL溶液，微波功率200 W，回流反应30 min，TLC检测反应完成后，将反应物置于冰水中，用乙酸乙酯萃取（25 mL×3），用无水硫酸钠干燥过夜，柱层析纯化流动相为二氯甲烷-丙酮（20:1），得白色固体0.671 5 g，产率86%。
3 药学性质研究分别用HPLC测定D3、D4的溶解度和lgP，通过软件ChemAxon16.1.18对其分子极性表面积、分子可极化率等进行计算，预测其在机体内的转运过程及生物活性。
3.1 色谱条件流动相：乙腈-甲醇（1:1）；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL；检测波长：230 nm或254 nm；柱温：25 ℃。
3.2 标准溶液的制备精密称取D3适量，用甲醇溶解，配成质量浓度为230 μg·mL-1的D3甲醇溶液，作为储备液置于4 ℃冰箱中储存。准确量取D3储备液适量，用甲醇稀释成质量浓度分别为0.460、1.15、2.30、4.60、9.20和18.40 μg·mL-1系列标准溶液，置4 ℃冰箱中储存，备用。同法制备D4质量浓度分别为0.488，1.22，2.44，4.88，9.76和19.52 μg/mL的系列标准溶液，置4℃冰箱中储存，备用。
3.3 检测方法的建立 3.3.1 线性关系考察取“3.2”项下D3、D4质量浓度的系列标准溶液，采用“3.1”项下色谱条件进行测定。以待测物质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，得D3、D4的回归方程：
| $ \begin{array}{ll}{Y=76.47 X+5.259} & {r^{2}=0.9910} \\ {Y=50.63 X+60.07} & {r^{2}=0.9980}\end{array} $ |
线性范围分别为0.46~18.4 μg·mL-1和0.488~ 19.52 μg·mL-1。
3.3.2 定量下限（LOQ）与检测下限（LOD）按照“3.2”项下方法制备含D3质量浓度为230 ng·mL-1的溶液，进行5样本分析，并根据标准曲线计算求得每一样本的浓度，测定该浓度下各成分的日内精密度（RSD）与准确度（RE）（表 1），结果表明RSD与RE均符合要求，由HPLC给出该浓度下的信噪比（S/N）为10，判定D3的LOQ为230 ng·mL-1。D4的LOQ的测定方法与D3一致，D4的LOQ为112 ng·mL-1，D4的LOQ浓度下的日内RSD、RE见表 1。将质量浓度为230 ng·mL-1的D3的样品稀释2倍后测定，由HPLC给出的S/N值为3，表明D3的LOD为115 ng·mL-1。相同方法下测定D4的LOD为41 ng·mL-1。
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表 1 D3、D4在LOQ浓度下的日内RSD、RE（n=5） Tab.1 Intra-day RSD and RE during validation period of D3, D4 from LOQ samples for determination |
制备D3和D4的低、中、高3个浓度的质量控制（QC）样品，每一浓度进行六样本分析，连续测定3 d，计算QC样品的浓度，与配制浓度对照，求算各成分测定方法的RSD与RE，结果见表 2。实验结果表明，D3、D4的日内精密度均在12%以内，日间精密度小于13%，准确度在-6.6%~13%，均在合理范围之内。
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表 2 D3、D4的测定方法的日内、日间RSD、RE（n=6） Tab.2 RSD and RE of the HPLC method in determining D3, D4 |
取水、甲醇、环己烷、乙酸乙酯各5 mL，分别置于4支试管中，加入过量的被测样品，在恒温（37±0.1）℃条件下振摇平衡48 h，取上清液用HPLC测定其溶解度[8]。对超出测定线性浓度范围的被测样品的溶液用甲醇稀释后测定。结果见表 3。
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表 3 D3、D4与DA1的溶解度、脂水分配系数a Tab.3 Solubility and partition coefficients of DA1 and its analogs D3 and D4 |
精密称取D3 5.1 mg，溶于50 mL水饱和的正辛醇溶液中，配成质量浓度为102 mg·L-1的溶液，取该溶液2 mL于10 mL具塞试管中，分别加入正辛醇饱和的水溶液2 mL。将配制好的样品溶液放入振荡器中振摇平衡，温度保持在（37 ± 0.1）℃，于避光条件下振摇过夜，再以3 000 r·min-1的速度离心10 min，取下层水相10 μL经高效液相色谱测定，记录峰面积，带入标准曲线计算药物在水相的浓度ρw。精密称取D4 5.2 mg，溶于50 mL水饱和的正辛醇中，配成质量浓度为104 mg·L-1的溶液，其余方法同D3的测定[8-9]。
脂水分配系数测定结果见表 3。在所有测定溶剂中，D3、D4的溶解度相对于DA1而言，有极大提高。在环己烷中，D3溶解度达到124.4 μg·mL-1，D4的溶解度高达到381.1 μg·mL-1，而原药DA1在环己烷中的溶解度不能测定。在乙酸乙酯中，D3的溶解度达到了6.15×104 μg·mL-1，相对于DA1的溶解度提高了4.73×105倍，D4在乙酸乙酯中的溶解度也提高了1.09×105倍，表明其脂溶性大大改善。同时，D3在水中也有一定的溶解度，说明对DA1的苯磺酸酯化修饰，既提高了脂溶性，也改善了水溶性。可能是由于引入苯磺酸酯基后导致分子内氢键的破坏，降低了分子的晶格能，导致亲脂亲水性均相应增加。
根据实验测定衍生物在水相的浓度ρw，由式（1）求出衍生物的lgP。ρ0为总浓度。
| $ \lg P=\lg \left(\rho_{0}-\rho_{\mathrm{w}}\right) / \rho_{\mathrm{w}} $ | (1) |
由式（1）求出D3、D4的lgP。从表 3可以看出，D3、D4的lgP分别为2.73和2.19。D3、D4的lgP均在2.0~3.0之间，处在对中枢神经系统和非中枢神经系统的口服活性药物最佳范围，预示该药代谢倾向较低和有良好的中枢神经系统渗透作用[10]。
4 药物的人主动脉血管平滑肌细胞吸收 4.1 细胞的培养与药物处理取HAVSMCs冻存管复苏，取传代3~10代的HAVSMCs于105密度分种与6孔板，每孔2 mL，置37 ℃、5%二氧化碳培养箱培养24 h，使细胞贴壁；换成无血清的DMEM培养液继续培养24 h，使细胞同步化，小心吸去上清液，分别加入不同浓度的药物溶液于10%血清的DMEM培养液中，空白HAVSMCs组加入等量的不含药物的DMEM培养液，每组设3个复孔，继续培养，分别在0.5、1、6、12、24、48 h不同时间点终止培养，分别收集细胞培养上清液于-80 ℃冰箱冷冻保存至分析测定。
4.2 细胞样品预处理[11]取-80 ℃冷冻的空白细胞上清液，常温解冻，涡旋1 min，取细胞上清液50 μL，加入甲醇50 μL，涡流混匀，加入乙酸乙酯1 mL，涡流3 min，3 000 r·min-1冷冻离心分离乙酸乙酯，氮气吹干，残余物用甲醇500 μL溶解后进样分析。
4.3 色谱条件流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（1:1），流速为0.5 mL·min-1，检测波长230 nm或254 nm，柱温25 ℃，进样量为10 μL。
4.4 系列标准溶液的制备精密称取DA1适量，用甲醇溶解，配成质量浓度为2.34 mg·mL-1的DA1甲醇溶液作为储备液，置于4 ℃冰箱中储存。准确量取DA1储备液适量，用甲醇稀释成质量浓度分别为5.85、11.7、23.4、117和234 μg·mL-1标准系列溶液，置4 ℃冰箱中储存，备用。相同方法制备D3的质量浓度分别为5.7、11.4、22.8、114和228 μg·mL-1的系列标准溶液，置4 ℃冰箱中储存，备用。同样方法制备D4的浓度分别为5.3、10.6、21.2、106和212 μg·mL-1的系列标准溶液，置4℃冰箱中储存，备用。
4.5 生物样品中药物浓度测定的液相色谱法的建立 4.5.1 线性关系考察取“4.1”项下冷冻保存的空白细胞上清液25 μL，常温解冻后，分别加入“4.4”项下方法制备不同质量浓度的DA1、D3和D4的系列标准溶液25 μL，涡流混合，其余同“4.2”项下细胞样品预处理”。以待测物浓度X为横坐标，待测物的峰面积Y为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，得DA1和D3、D4的回归方程：
| $ \begin{array}{ll}{Y=103.7 X-434.2} & {r^{2}=0.9930} \\ {Y=66.68 X+2.789} & {r^{2}=0.9990} \\ {Y=33.46 X+10.65} & {r^{2}=0.9990}\end{array} $ |
线性范围分别为0.293~11.7 μg·mL-1，0.285~11.4 mg·mL-1和0.265~10.6 mg·mL-1。
4.5.2 LOQ与LOD制备DA1质量浓度为293 ng·mL-1的标准溶液5份，根据标准曲线，求得每一的浓度，计算该浓度下各成分的日内RSD与RE，见表 4，结果表明RSD与RE均符合要求，由HPLC给出该浓度下的S/N为10，表明DA1的LOQ为293 ng·mL-1。D3、D4的LOQ的测定方法与DA1一致，D3、D4的LOQ分别为285 ng·mL-1和265 ng·mL-1，D3、D4的LOQ浓度下的日内RSD、RE见表 4。将质量浓度为293 ng·mL-1的DA1的标准溶液稀释5倍后测定，由HPLC给出的S/N值为3，确定DA1的LOD为58.5 ng·mL-1。相同方法下测定D3、D4的LOD分别为23.8 ng·mL-1和88.0 ng·mL-1。
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表 4 DA1与D3、D4在定量下限浓度下的日内精密度、准确度（n=5） Tab.4 Intra-day RSD and RE from LOQ samples for determination of DA1, D3 and D4 during validation period (n=5) |
取解冻后的空白细胞上清液25 μL，加入DA1（或D3、D4）标准溶液25 μL，制备低、中、高3个浓度的QC样品各6份，连续测定3 d，计算QC样品浓度与配制浓度对比，计算各成分日间和日内精密度，结果见表 5，均在合理范围内。
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表 5 DA1与D3、D4的测定方法的日内、日间精密度、准确度（n=6） Tab.5 RSD and RE of the HPLC method in determination of DA1, D3 and D4(n=6) |
取-80 ℃冷冻的细胞上清液，常温解冻，涡旋1 min，取加药细胞上清液50 μL，其余同“4.2细胞样品预处理”项下方法处理。取处理后的溶液进样分析。
4.7 数据处理根据每个分析批建立的标准曲线，计算细胞上清液中药物浓度。实验数据采用t检验进行统计学分析，若P < 0.05则认为存在显著性差异，P < 0.01则认为有极显著性差异，P > 0.05则没有显著性差异。
4.8 HAVSMCs对DA1及其衍生物的吸收利用空白HAVSMCs上清液的高效液相色谱图见图 2-A；DA1培养HAVSMCs 0.5 h后细胞上清液的高效液相色谱图见图 2-B，其保留时间为7.331 min；D3培养HAVSMCs 0.5 h后细胞上清液的高效液相色谱图见图 2-C，其保留时间为12.285 min；D4培养HAVSMCs 0.5 h后细胞上清液的高效液相色谱图见图 2-D，其保留时间为12.846 min。在D3、D4的细胞上清液中未见到DA1，表明D3、D4在细胞培养基中比较稳定。
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图 2 DA1及衍生物的细胞上清液高效液相色谱图 Fig.2 HPLC of cell supernatant of DA1 and its derivatives |
以细胞系统培养液中药物浓度的减少为细胞对药物的吸收量，由式（1）计算DA1及D3、D4的吸收及其吸收利用率。c0：细胞药物初始浓度，c：某一时刻细胞上清液浓度。结果如图 3和表 6所示。由表 6和图 3可知，DA1在0.5 h达到最大吸收，吸收率达到20.29%，随着时间增加，吸收达到饱和，吸收率维持在20%左右；D3在12 h达到最大吸收，细胞上清液药物浓度降低了43.57 μg·mL-1，吸收率达到了74.3%；D4在0.5 h达到7.1%，随着时间延长，药物的细胞吸收率没有明显改变，维持在8%左右。
| $ 吸收率=\frac{c_{0}-c}{c_{0}} \times 100 \% $ | (1) |
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图 3 DA1及衍生物的HAVSMCs的吸收（n=3） Fig.3 Effect of DA1 and its derivatives on HAVSMCs uptake |
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表 6 DA1及其衍生物的细胞吸收利用 Tab.6 The absorptions of DA1 and its derivatives by cells |
DA1与D3、D4的化学结构式与最低能量构象见图 4（最低能量构象由Chemoffice 2002搜寻得到），结构特征与药学性质的实验与计算结果见表 7。
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图 4 DA1、D3和D4的化学结构式与最低能量构象 Fig.4 Structural formula and minimize energy conformation of DA1, D3 and D4 |
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表 7 DA1、D3和D4的结构特征和药学性质a Tab.7 Structural characteristics and Pharmaceutical properties of DA1, D3 and D4a |
本文主要从改善异黄酮DA1的生物活性出发，对原药DA1酯化修饰，改善脂溶性，使其易于穿越细胞膜，从而有可能提高药物的口服生物利用度和生物活性。适宜的相对分子质量对药物的口服吸收性是重要因素，由表 7可知，D3、D4相对分子质量分别为408、422，均小于500，符合“Lipinski五倍率法则”[7]。D3、D4的熔点均较原药DA1大幅度下降，处在适宜的药物熔点范围100~200 ℃。熔点过高，由于高晶格能而降低水溶性，这也解释了脂溶性D3的水溶性增加的原因。
由表 7可知：D3、D4的氢键形成能力相对于原药DA1而言，分子的氢键供体位点从1减少为0，但氢键受体位点从9增加到10，表明衍生物的氢键成键能力增强。修饰后的D3、D4的摩尔折射率均增加，处在40~130之间，符合“Lipinski五倍率法则” [7]。
由表 7可知，经修饰后的D3、D4的可极化率与原药DA1相比均增加。由图 3可知：原药DA1引入苯磺酸酯基后，在分子中形成正电荷中心。由于S具有很大的可极化率，一方面分子的变形性增加，有利于药物分子以适当的构型与受体蛋白进行互补性结合而产生药效[12-14]。表明在DA1引入苯磺酸酯基的修饰，优化其药效学构像，增加了分子的可极化率和变形性，有利于衍生物分子与受体蛋白的相互作用而提高活性。
ChemAxon16.1.18的计算结果表明：D3、D4的分子极性表面积（2D）均为78.9 Ǻ2，较原药DA1高，可能降低药物的脂质通透能力[11]，但D3、D4的分子极性表面积（2D）均在120 Ǻ2以内。同时D3、D4相对于原药DA1而言，封闭了酸性基团羟基，降低分子的pKa，相反有可能改善其吸收率。由表 6可以看到，D3的吸收率高于原药DA1，证实了这一点。
从表 7可以看出：衍生物的lgP由Chem Axon 16.1.18的计算值与实验值差距明显，可能主要是ChemAxon16.1.18没考虑到多羟基黄酮的分子内氢键导致的晶格能较高，从而使其分子亲水性很不理想的因素。由表 3、7可知，对DA1的苯磺酸酯修饰达到了提高脂溶性的目的，衍生物亲脂性的提高，并且衍生物的脂水分配系数处在适宜的分配系数1~3之间，符合“Lipinski五倍率法则”[7]。
由表 6可知，D3的细胞吸收率大大提高，相对与原药DA1最大吸收率提高了3.7倍，说明通过化学修饰，在DA1的7位上引入苯磺酸酯基，在4’-引入甲基，D3脂溶性提高，同时水溶性也提高了（表 3），有利于药物的吸收。lgP高的衍生物意味着脂溶性强，容易穿越细胞膜，但如果分子的水溶性很低，也不利于分子吸收[11]。D4的细胞吸收率维持在8%左右，相比原药DA1，吸收率反而降低了，表明药物适宜水溶性的重要性。由图 3可知，D4与DA1比较，通过在DA1的7-引入苯磺酸酯基，4’-引入乙基，根据表 3，发现D4的结构改造，虽然脂溶性提高，但水溶性没有变化，吸收性反而降低了。D4与D3对比，两者在结构是仅仅是甲基变为乙基，但两者的水溶性明显不同，导致药物的细胞吸收率差别很大，D3的最大吸收率是D4的8.5倍。结果表明，药物的细胞吸收性跟化合物的脂溶性和水溶性均有重要关系。
总之，研究表明，DA1的苯磺酸酯修饰物的药学性质得以明显优化。对D3、D4而言，适中的相对分子质量、增加的亲脂亲水性、适宜的lgP、低的pKa、恰当的分子极性表面积、增强的氢键成键能力、增加的可极化率和变形性，预示衍生物可能有相对较好的过膜吸收性转运分布性，良好的口服生物利用度和生物活性。
6 小结本文采用微波合成方法成功地合成了DA1苯磺酸酯衍生物，缩短了反应时间。在对衍生物的药学性质研究中，尽管以DA1的亲脂性修饰出发，但意外地发现部分修饰物的水溶性相对于原药也有显著的提高，从而使药物在HAVSMCs吸收性大幅度提高。DA1经苯磺酸酯化修饰后，药学性质得以全面优化，预示着该类衍生物可能有相对较好的吸收转运特性和生物活性。
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