2019, Vol. 39 
2. 天津药物研究院, 新药设计与发现重点实验室, 天津 300193;
3. 天津药物研究院, 天津市释药技术与药代动力学国家重点实验室, 天津 300193
2. Tianjin Key Laboratory of Molecular Design and Drug Discovery, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China;
3. Tianjin Center for New Drug Evaluation and Research, State Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Pharmaceutics, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China
细胞色素P4502D6（CYP2D6）酶是细胞色素P450（CYP450）中最重要的亚型酶。虽然仅占肝脏CYP450蛋白酶总量的2%~4%，但它能够代谢临床25%的药物[1]。目前已有研究报道CYP2D6表现为广泛的基因多态性，已超过100种人类CYP2D6等位基因被报道（http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm）。大量的体内研究文献证实了CYP2D6酶多态性与药物在人体内的代谢变异性有密切联系，可以通过对药物的代谢影响药效和药物毒性[2]。
CYP2D6酶抑制会引起药物相互作用（DDIs），进而导致药物不良反应或毒性。药物代谢相互作用中，酶抑制引起的DDIs占全部相互作用的70% [3-4]。但目前仅有小部分研究涉及药物对CYP2D6酶的抑制作用[5-6]。基于准确控制疗效和避免毒性的目的，详细和系统地研究药物对CYP2D6酶的抑制作用具有重要意义。在本试验中，选择亚洲人群中最具代表性的4种酶:CYP2D6*1、CYP2D6*2、CYP2D6*10和CYP2D6*39。其中CYP2D6*2和CYP2D6*10在亚洲人群中有较高的频率，分别为10%和56.2%。CYP2D6*39在亚洲人群中占据的频率为0.5%，但基于41.7亿的亚洲人口且目前没有展开相关的DDIs研究，研究此酶也很重要[7-8]。另外选择的6种药物包括奎尼丁、普罗帕酮、阿米替林、利培酮、氟伏沙明和美托洛尔在临床上经常与CYP2D6的底物联用[9-10]。因此，研究它们对CYP2D6酶的潜在抑制作用对临床上药物剂量调整以及避免DDIs具有指导意义。
根据FDA的指导原则，选用右美沙芬O-去甲基反应作为CYP2D6酶活性的探针反应[11]。为获得较精准的IC50值，需准确测定去甲右美沙芬的浓度。目前去甲右美沙芬的测定方法有HPLC-MS/MS[12]、HPLC-FLD[13]和GC/MS[14]。本试验中，将LC-MS/MS作为潜在抑制剂筛选实验中最常用的分析方法[15]，它具有多种优点，比如微量的样品体积，较短的分析时间，极好的灵敏度，超高的准确度以及高通量的特点[16-17]。
本次试验建立并验证了在CYP2D6酶孵育体系中测定去甲右美沙芬浓度的LC-MS/MS方法。同时得到了6种药物对4种CYP2D6酶的IC50值并进行了比较。考察CYP2D6突变对抑制剂响应作用的变化，为个体化用药提供参考。
1 材料 1.1 仪器LC-MS/MS系统（Waters公司）:UPLC-TQD型三重四极杆串联质谱仪，配有输液泵、自动进样系统、电喷雾离子化源以及Masslynx 4.1数据处理工作站；XS105型分析天平（METTER TOLEDO公司）；Centrifuge 5415R高速离心机（Eppendorf公司）；VORTEX-QILINBEIER 5型涡旋混合器（江苏海门市其林尔仪器制造有限公司）；梅特勒微量移液器（METTER TOLEDO公司）；N-EVAPTM112氮吹仪（Organomation Association，Inc）。
1.2 试剂和材料氢溴酸右美沙芬（批号P1096495，含量98%，上海阿达玛斯试剂有限公司）；去甲右美沙芬酒石酸盐（批号6-JKD14，含量99%，Toronto Research Chemicals Inc）；非那西汀（批号J1526019，含量98%，上海阿拉丁生化科技有限公司）；抑制剂:奎尼丁（批号Q1633141，含量98%），普罗帕酮（批号H1602067，含量98%），阿米替林（批号D1510066，含量98%），利培酮（批号K1710065，含量99%），氟伏沙明（批号G1521009，含量98%），美托洛尔（批号C1728822，含量98%），6种抑制剂均来自于上海阿拉丁生化科技有限公司；纯水采用Thermo Scientific Barnstead纯水制备系统自制，电阻率≧18.2 MΩ·cm；甲醇（色谱纯，Fisher公司），乙腈（色谱纯，Fisher公司），甲酸（色谱纯，Dikma公司），烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH批号1706012，含量95%，上海阿拉丁生化科技有限公司）；CYP2D6*1（野生酶，批号CYP/EZ007），CYP2D6*2（Arg296Cys，Ser486Thr，批号CYP/EZ027），CYP2D6*10（Pro34Ser，Ser486Thr，批号CYP/EZ029），CYP2D6*39（Ser486Thr，批号CYP/EZ030），4种CYP2D6酶均来源于上海瑞德肝病研究有限公司，浓度1.0 nmol·mL-1；K2HPO4·3H2O（色谱级，批号20170110，含量99%，天津科密欧试剂），KH2PO4（色谱级，批号20160411，含量99%，天津光复精细化工研究所），MgCl2·6H2O（色谱级，批号20170214，含量99%，天津市风船化学试剂科技有限公司）。
2 方法 2.1 实验条件 2.1.1 色谱采用Waters公司Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流动相A为0.05%甲酸水溶液（v/v），流动相B为甲醇，梯度洗脱（0.0~2.0 min:10%B→70%B；2.0~3.5 min:70%B；3.5~3.7 min:70%B→90%B；3.7~4.7 min:90%B；4.7~5.0 min:90%B→10%B；5.0~6.0 min:10%B），柱温40 ℃，进样器温度15 ℃，进样时间为6 min，进样体积5 μL。
2.1.2 质谱采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式。毛细管电压为2.5 kV；锥孔电压为30 V；源温度为150 ℃；去溶剂温度为350 ℃；气帘气为50 L·h-1；去溶剂气为800 L·h-1。去甲右美沙芬的离子通道为m/z 257.96→157.02，锥孔电压为26 V，碰撞能量为36 eV；内标的离子通道为m/z 179.90→109.94，锥孔电压为34 V，碰撞能量为20 eV。扫描方式为多反应监测（MRM）。
2.2 溶液配制 2.2.1 PBS溶液及启动液含80.01 mmol·L-1 K2HPO4·3H2O，19.99 mmol·L-1 KH2PO4，5.02 mmol·L-1 MgCl2·6H2O，超纯水做溶剂（电阻率18.2 MΩ·cm），最后用磷酸调节pH=7.4（用临配临）。称取适量还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH），用PBS溶液溶解配制成浓度为20 mmol·L-1的启动液（临用临配）。
2.2.2 去甲右美沙芬对照品系列标准工作液精密称取去甲右美沙芬对照品适量，置于50 mL量瓶中，用纯甲醇溶解并定量至刻度，摇匀，配成终质量浓度为1 000 μmol·L-1的去甲右美沙芬溶液。精密吸取去甲右美沙芬溶液适量，用现配制的PBS溶液梯度稀释配制去甲右美沙芬对照品系列标准工作液，质量浓度分别为60、100、500、2 400、4 800、6 000 nmol·L-1，临用临配。
2.2.3 内标溶液精密称取非那西汀对照品适量，用甲醇溶解配成终质量浓度为300 nmol·L-1的内标溶液，储存在-4 ℃条件下。
2.3 抑制试验根据查阅的文献[18-19]，CYP2D6*1，CYP2D6*2，CYP2D6*10和CYP2D6*39孵育终体系内底物浓度分别为0.35、0.60、7.0和0.80 μmol·L-1。去甲右美沙芬的产量与孵育时间和孵育酶量均成线性。所用抑制剂均用PBS溶液或纯水配制以满足孵育体系中有机相体积不超过1% [19]。所选用抑制剂的浓度范围分别为奎尼丁（0.003~0.600 μmol·L-1）、普罗帕酮（0.050~2.00 μmol·L-1）、阿米替林（2.00~60.0 μmol·L-1）、氟伏沙明（1.00~100 μmol·L-1）、利培酮（2.00~100 μmol·L-1）和美托洛尔（5.00~150 μmol·L-1）。
实验操作:分别精确吸取20 μL上述选用底物浓度相应的标准工作液和抑制剂溶液，加入3 μL或6 μL的CYP2D6酶（CYP2D6*1为6 μL，CYP2D6*1、CYP2D6*2、CYP2D6*39为3 μL）再加入134~137 μL PBS溶液进行涡旋混匀3 min。混合溶液预孵育5 min，然后将预孵育体系取出加入现配的NADPH启动液（20 mmol·L-1）20 μL，启动反应，涡旋混匀3 min。终体积为200μL的孵育体系继续孵育8 min。孵育完成后加“2.2.3”项的内封溶液600 μL终止反应。然后涡旋混匀，在15 ℃，13 000 r·min-1条件下离心7 min，取上清液进样200 μL进行LC-MS/MS分析。同法制备不含抑制剂的对照品溶液。每个孵育试验重复3次，结果用平均值表示。
3 结果 3.1 孵育体系优化在进行抑制试验之前，体外孵育体系需优化得到合适的线性范围。优化的3个相关的试验参数分别为底物浓度、孵育时间和孵育酶量。选择合适的底物浓度对测定抑制数据十分重要，低于米氏常数（Km）或等于Km的一般被推荐作为合适的底物浓度。因为此浓度能同时保证酶量与底物的充足，减小线性误差能够更准确的得到IC50值[20-21]。根据文献[20-21]选择CYP2D6*1、CYP2D6*2、CYP2D6*10和CYP2D6*39的底物浓度分别为0.35、0.60、7.0和0.80 μmol·L-1。
孵育时间和孵育酶量也会影响IC50值的获取。孵育时间过长会造成产物浓度与时间不成线性，而孵育时间过短会导致产物浓度太低而无法测定。因此固定酶浓度为15或30 pmol·mL-1，确定各个酶的孵育时间范围:CYP2D6*1、CYP2D6*2和CYP2D6*39为2~10 min，CYP2D6*10为4~15 min。通过固定孵育时间（8 min）确定各个酶的孵育量范围:CYP2D6*1、CYP2D6*2和CYP2D6*39是5~25 pmol·mL-1，CYP2D6*10是5~30 pmol·mL-1。最终确定孵育时间为8 min，CYP2D6*1、CYP2D6*2和CYP2D6*39的孵育酶量为15 pmol·mL-1，CYP2D6*10孵育酶量为30 pmol·mL-1。
3.2 方法学验证根据FDA中的“生物分析方法的验证指南”对LC-MS/MS进行了以下验证[22]。
3.2.1 专属性根据“2.1”项实验条件下，分别测定了3种情况下的样品:只添加4种CYP2D6酶和NADPH不添加底物为空白样品（A）；酶先失活后再添加底物和NADPH为对照体系（B）；酶失活后添加NADPH和去甲基右美沙芬为标准样品（C）；酶正常催化孵育体系（D）；酶正常催化体系中加入抑制剂（E）。根据结果，证明4种酶和NADPH均不干扰产物的检测，失活后的酶无催化能力。在体系中，产物去甲基右美沙芬和内标出峰位置分别为2.10 min和2.43 min。方法具有较高的特异性，见图 1。
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A.空白样品（blank sample）：酶+NADPH（enzyem+NADPH）B.对照体系（control sample）：失活后的酶、NADPH和底物+300 nmol·L-1非那西汀（inactivated enzyme，NADPH，substrate spiked with 300 nmol·L-1 phenacetin）C.酶正常催化孵育体系：7 μnmol·L-1底物孵育终浓度，30 pmol·mL-1 CYP2D6*10体外孵育8 min，去甲右美沙芬的浓度为409.90 nmol·L-1（CYP2D6 enzyme incubation system：substrate incubation concentration of 7 μnmol·L-1 and 30 pmol·mL-1 CYP2D6*10 incubated for 8 min，dextrorphan at 409.90 nmol·L-1）D.酶正常催化体系中加入抑制剂：7 μnmol·L-1底物孵育终浓度，30 pmol·mL-1 CYP2D6*10，0.50 μmol·L-1奎尼丁，体外孵育8 min，去甲右美沙芬浓度156.70 nmol·L-1（CYP2D6 enzyme incubation systen spiked with inhibitor，7 μnmol·L-1 substrate，30 pmol·mL-1 CYP2D6*10 and 0.50 μmol·L-1 quinidine incubated for 8 min，dextrorphan at 156.70 nmol·L-1）E.标准样品：失活后的酶、NADPH和600 nmol·L-1 DXT+300 nmol·L-1非那西汀（standard sample：inactivated enzyme，NADPH，600 nmol·L-1 dextrorphan spiked with 300 nmol·L-1 phenacetin） 图 1 5种情况下的LC-MS/MS色谱图 Fig.1 LC-MS/MS chromatograms of 5 kinds of secuations |
分别取“2.2.2”项下浓度为60、100、500、2 400、4 800、6 000 nmol·L-1的去甲右美沙芬对照品标准工作液20 μL，加失活酶处理液（3 μL或6 μL酶加入NADPH 20 μL，90 ℃水浴10 min后加入157 μL或154 μL PBS，冷却至室温）180 μL，涡旋混匀3 min，制备得到相当于6.00、10.0、50.0、240、480、600 nmol·L-1的含去甲基右美沙芬的反应液，按照“2.3”项加入600 μL非那西汀甲醇工作液（300 nmol·L-1）后处理样品，进样。以去甲右美沙芬浓度作为横坐标，以去甲右美沙芬与内标峰面积比值作为纵坐标，经过加权（W=1/x）最小二乘法进行线性回归运算，制备标准曲线，回归方程:
| $ Y=0.0404 X+0.00024 \quad r^{2}=0.9993 $ |
线性范围为6.00~600 nmol·L-1，定量下限（S/N≥10）为6.00 nmol·L-1。检测下限（S/N≤3）为2.00 nmol·L-1。
3.2.3 精密度和准确度分别按照“3.2.2”项下方法配制6.00、50.0、600 nmol·L-1的3个浓度的酶促反应液各15份作为质控样品，每天分别测定3个浓度各5份，按照“2.3”方法处理样品后进样，连续测定3 d，计算批间、批内精密度和准确度，结果见表 1。去甲右美沙芬在体外CYP2D6酶孵育体系中的批内、批间精密度RSD < 15%，符合生物样品测定要求
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表 1 酶促反应液中去甲右美沙芬的准确度和精密度 Tab.1 Accuracy and precision of dextrorphan in CYP2D6 enzyme incubation system |
按照“3.2.2”项下方法配制浓度为6.00、50、600 nmol·L-1的3个浓度的酶促反应液各5份作为质控样品，按照“2.3”项下方法处理样品后进样分析，分别记录去甲右美沙芬和非那西汀的峰面积为A1去右和A1非。同上用PBS溶液代替失活酶处理液，配制3个浓度各5份的质控样品，按照“2.3”项下方法处理，进样分析，分别记录去甲右美沙芬和非那西汀的峰面积为A2去右和A2非，以A1去右/A2去右×100%和A1非/A2非×100%计算去甲右美沙芬和非那西汀的绝对回收率，取均值。在本文条件下，低、中、高3个浓度的去甲右美沙芬绝对回收率分别为93.4%±2.8%、109.8%±2.0%和93.07±4.75%，RSD分别为3.0%、1.8%、5.1%；内标非那西汀的绝对回收率为93.0%±1.8%、103.8%±2.2%和95.1%±2.9%，RSD分别为1.9%、2.1%、3.0%
3.2.5 基质效应配制6.00、50.0、600 nmol·L-1 3个浓度的基质效应测定溶液，移取对应浓度的去甲右美沙芬对照品标准工作液20 μL，加入180 μL的PBS溶液和600 μL的内标工作液（含非那西汀300 nmol·L-1），涡旋3 min混合均匀，每个浓度配制10份供试溶液。分别取3个浓度各5份溶液进样，记录去甲右美沙芬和非那西汀的峰面积为B1去右、B1非。另外移取3 μL或6 μL的酶，加入20 μL NADPH溶液，在90℃水浴中放置10 min使酶失活，加入157 μL或154 μL纯水和600 μL甲醇，涡旋混合均匀，离心沉淀，取全部上清液，用氮气吹干，共配制15份。分别取之前剩余的3个浓度各5份供试溶液，加入到吹干的酶（含NADPH）中，涡旋3 min混合均匀，在离心机中（15 ℃，13 000 r·min-1）离心7 min，取上清液进样，记录去甲右美沙芬和非那西汀的峰面积为B2去右、B2非，以B1去右/B2去右×100%和B1非/B2非×100%计算去甲右美沙芬和非那西汀的基质效应，取均值。在本文条件下，低、中、高3个浓度的去甲右美沙芬基质效应分别为98.5%±6.7%、114.7%±5.2%和92.8%±4.0%，内标非那西汀的基质效应为97.6%±5.2%、107.5%±3.5%和95.6%±2.8%，说明在本实验条件下基质对测定无影响[23]。
3.2.6 稳定性按照“3.2.2”项下方法配制6.00、600 nmol·L-1这2个浓度的酶促反应液的质控样品，每个浓度配制18份。其中取出2个浓度各6份，按照“2.3”项下方法，处理后放置于进样仓中24 h后重新进样，分别记录浓度；另取2个浓度各6份样品，置于室温下24 h后按照相同方法处理，进样，记录浓度；最后2个浓度各6份样品，在-20 ℃冰箱中冻融循环3次，按照相同方法处理，进样，记录浓度。结果表明，去甲右美沙芬在酶促反应液中稳定性良好，符合生物样品测定要求。
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表 2 去甲基右美沙芬在多种储存条件下的稳定性 Tab.2 Stability results of dextrorphan under different storage conditions |
上述所建立的CYP2D6酶体外孵育方法和LC-MS/MS方法适合抑制剂的测定。测得的去甲右美沙芬的浓度与相对应加入的抑制剂浓度用GraphPad Software（PRISM version 5.0）作图，符合非线性回归分析中的剂量-响应抑制方程。所用抑制剂中，奎尼丁是经典的非底物型抑制剂，作为阳性对照表明CYP2D6孵育体系的有效性（见图 3）。实验所测得的奎尼丁的IC50值与FDA及其他研究者所报道的数据（0.035~0.2 μmol·L-1）相吻合[24]。实验结果（见表 3）表明，同一药物对4种不同CYP2D6酶的IC50值有显著区别。具体来说所有抑制剂均抑制了CYP2D6*1酶的催化活性，其中奎尼丁和普罗帕酮是最强的抑制剂，IC50值分别为0.030、0.33 μmol·L-1，再者阿米替林、利培酮、氟伏沙明是次强的抑制剂，它们的IC50值在6.0~8.0 μmol·L-1之间。美托洛尔是最弱的抑制剂，其IC50值大于39.00 μmol·L-1。另外，各个抑制剂对CYP2D6*10的IC50值是对野生酶IC50值的5~6.7倍。而抑制剂对CYP2D6*2和CYP2D6*39的IC50值与野生酶的IC50值相比差别不大。
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A. CYP2D6*1 B. CYP2D6*2 C. CYP2D6*10 D. CYP2D6*39 图 3 奎尼丁对4种CYP2D6酶的体外孵育抑制实验（奎尼丁浓度:0.003~0.600 μmol·L-1） Fig.3 The inhibitory effect of quinidine on CYP2D6 enzymes using enzyme incubation system in vitro (quinidine concentration:0.003-0.600 μmol·L-1) |
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表 3 各个抑制剂对4种CYP2D6酶的IC50值（μmol·L-1） Tab.3 Values of IC50 of each inhibitor towards four different CYP2D6 enzymes |
选择合适的内标是提高LC-MS/MS方法准确度的重要手段，在本试验中非那西汀被选作合适的内标因为它具有以下优点:较好的溶解性，相似的极性，对称的峰形和近似相同的保留时间[25]。经过内标浓度优化，最终选用300 nmol·L-1作为固定浓度，使其峰响应与待测物峰响应相同。
根据实验结果可知，奎尼丁和普罗帕酮是最强的抑制剂，阿米替林、利培酮、氟伏沙明是中等强度的抑制剂，美托洛尔是最弱的抑制剂。此结果可预测与CYP2D6酶相关的药物相互作用。以氟伏沙明（抑制剂）-氯氮平（底物）为例，氯氮平由CYP2D6代谢，氟伏沙明是CYP2D6的竞争型抑制剂，根据方程:Ki=IC50/1+（[S]/Km），[S]代表底物浓度（1）和AUC ratio=AUC（有抑制剂）/AUC （无抑制剂）=1+[I]/Ki，[I]代表抑制剂浓度（2）可知，若CYP2D6*1体内药物曲线下面积定义为4.0 ng·min·mL-1，则CYP2D6*2、CYP2D6*10和CYP2D6*39酶突变体内药物曲线下面积可依次预测为14、1.4和5.0 ng·min·mL-1[26]。建议普罗帕酮、阿米替林、利培酮、氟伏沙明和美托洛尔与CYP2D6酶的底物合用时应对药物浓度进行临床的实时监测。
另外，各个抑制剂对CYP2D6*10的IC50值是野生酶IC50值的2.5~6.7倍，而抑制剂对CYP2D6*2和CYP2D6*39的IC50值与野生酶的IC50值相比差别不大。最重要的是药物对CYP2D6*39抑制数据为第一次被报道。其IC50值与野生酶IC50值相差不大，表明Ser486Thr突变与催化位点或结合位点无关，由此可知底物在CYP2D6*39个体的代谢情况应与野生酶大概一致。抑制剂对CYP2D6*10的抑制作用最弱的结果表明，Pro34Ser和Ser486Thr 2种氨基酸突变极大地影响了CYP2D6*10的催化能力，且这种弱催化性在酶与底物的相互作用中被证实[11, 27]。抑制剂对CYP2D6*1、CYP2D6*2和CYP2D6*39相差不大的抑制作用说明，与之相关的氨基酸突变对催化或结合位点的影响较小，这种类似的催化能力在CYP2D6酶与硫利达嗪、他莫昔芬、文拉法辛的代谢实验中被验证[28-29]。因此，可以根据突变酶与底物间的不同代谢作用推测突变酶与抑制剂之间可能的相互作用，有助于评价药物安全性，对临床合理用药具有指导意义。
本研究结果发现CYP2D6*10可以减弱抑制剂的抑制能力，提示这种表型与抑制的相互作用减弱，因此，具有这种表型的人群在临床上使用相关药物时，不能基于野生型CYP2D6的相互作用数据进行判断。
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