2019, Vol. 39 
2. 烟台正海生物科技股份有限公司, 烟台 264000
2. Zhenghai Biotech Co., Ltd., Yantai 264000, China
真皮组织在皮肤移植中可发挥抑制肉芽组织生长和瘢痕形成，降低创面挛缩等重要作用，因此，同种异体脱细胞真皮基质结合自体表皮移植在临床上获得了较好的皮肤修复效果，并且也扩展到口腔黏膜缺损修复、软组织填充等其他用途。由于同种异体材料来源有限，异种脱细胞真皮基质的应用开始进入了研究视野。但异种组织在人体使用有更高的免疫排斥风险，早期的组织处理方式是用戊二醛交联固定组织中的蛋白质，降低其抗原性，因戊二醛存在残留毒性，又发展出环氧化物等固定处理技术。但异种组织交联固定后基本不可降解或只能缓慢降解，与正常组织修复过程不能很好地匹配。因此，脱细胞工艺成为异种组织可供选择的另一种处理方法。理想的脱细胞处理是采用组合的化学试剂去除非预期的组织成分，主要是细胞及细胞成分，包括细胞DNA，细胞膜脂质、蛋白成分等，以降低人体不良免疫反应和免疫排斥的风险[1-2]，同时脱细胞处理不对细胞外基质成分和结构产生不利影响[3]。实际的脱细胞处理不同于特定的细胞外基质成分的分离纯化，难以避免细胞或细胞成分的残留，因此，对异种脱细胞基质进行免疫学评价是动物源性生物材料和产品生物学风险评价必不可少的环节。
异种脱细胞基质可能残留的细胞和细胞成分种类很多，α-Gal抗原是其中主要的一类，它分布在除人类及类人猿、旧世纪猴以外的动物细胞表面和分泌的糖蛋白和糖脂分子上。常用的实验动物因自身表达α-Gal，不能用于评价可能在人体发生的与Gal抗原相关的免疫毒性反应。而不表达α-Gal的GGTA1基因（α-Gal的调控基因）敲除小鼠（Gal抗原缺失小鼠）在用于动物源性生物材料免疫原性评价时，除能反映与用野生型小鼠开展的试验研究相同的植入反应外，还可针对性地评价与残留α-Gal相关的免疫原性风险，如在Gal抗原缺失小鼠植入异种补片后可观察到T-cell依赖的抗Gal抗体反应[4]，植入异种心脏补片后可观察到免疫排斥反应[5]等。本课题组建立了自主研发的GGTA1基因敲除Gal抗原缺失小鼠，并验证了该小鼠对于含Gal抗原的兔血红细胞膜以及动物源性生物材料（牛心包组织）的免疫原性评价具有很好的敏感性[6-7]。为客观地评价可降解牛源脱细胞真皮基质产品的免疫原性，本研究采用Gal抗原缺失小鼠，对牛脱细胞真皮基质及其原材料进行了降解过程中不同时点的免疫风险评价。
1 材料、试剂与仪器设备Gal抗原缺失小鼠，4~5周龄，72只，雌雄各半，由中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所模式动物室繁育（课题组自主研发，并建系保种）。
牛真皮基质和牛脱细胞真皮基质由烟台正海生物科技股份有限公司提供。小鼠IgG ELISA试剂盒（欣博盛，EMC116），小鼠IgM检测试剂盒（欣博盛，EMC129），羊抗鼠IgG-HRP（Santa Cruz Biotechnology，sc-2005），羊抗鼠IgM-HRP（Santa Cruz Biotechnology，sc-2064），Gal-BSA（Dextra Laboratories，3-Atom spacer，NGP0203），人血清白蛋白（Sigma，A8230-1），四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，TMB，北京科悦达，SE1005），吐温-20（北京索莱宝，T8220），磷酸盐缓冲液（PBS，Hyclone，SH30256.01B），1640培养液（Hyclone，SH30809.01），胎牛血清（杭州四季青，150119），细胞因子测试试剂盒（BD Biosciences，558266、558296、560151、558298、558300），细胞表面抗体测试试剂盒（BioLegend，100305、100707、104507、103132、100412、115512、108910）。96孔酶标板（Costar，2592），终止液（10%硫酸，国药集团，7664939），红细胞裂解液（北京科悦达，KS801-100），70 µm细胞筛网（SPL Life Scineces，SPL-93070）。甲醛，苏木色精，伊红，酒精，中性树胶，二甲苯均购自国药集团化学试剂有限公司。
Spectramax M5酶标仪（MD公司），离心机3k-15（Sigma），HZQ-X100摇床（太仓豪诚公司），150i CO2培养箱（Thermo公司），FA1104H 10万分之一天平（上海民桥公司），LSRII流式细胞仪（BD Biosciences公司），KD-BM生物组织包埋机（科迪公司），RM2016组织切片机（LEICA公司），CI-S光学显微镜（Nikon公司）。
2 方法 2.1 植入试验采用兔血红细胞对Gal抗原缺失小鼠进行预免疫刺激（腹腔注射）[6]，诱导小鼠体内产生特异性抗-Gal抗体（使其尽可能接近人体表达水平）。每隔2周腹腔注射1×108个兔血红细胞，连续注射2次。
第2次兔血红细胞免疫刺激1周后，开始植入试验。每个植入周期的24只小鼠随机分为3组，雌雄各半。5%水合氯醛腹腔注射麻醉，备皮，双侧后肢外侧约1 cm切口，在每侧股骨外侧肌肉间植入材料，即每只小鼠植入2片10 mm×2 mm×2 mm的材料。其中对照组（Con组）进行“假手术”，未植入材料。牛真皮基质组（T1组）植入牛真皮基质原材料，脱细胞真皮基质组（T2组）植入脱细胞牛真皮基质材料。
2.2 取材植入4、12、52周后，小鼠麻醉后摘眼球取血，血液静置2 h后3 000 r·min-1离心15 min分离血清，分装后-80 ℃冻存备用。将小鼠脱颈处死，浸泡75 %酒精消毒，在无菌条件下取脾，部分脾组织用于组织病理学检查，部分用于分离获取脾淋巴细胞用于试验。再取小鼠胸腺及包含植入物的局部肌肉组织用于组织病理学检查。
2.3 血清总IgG、IgM检测根据预实验结果选择合适的血清稀释度。4、12周小鼠血清稀释4万~8万倍，52周小鼠血清稀释16~32万倍用于IgM检测；4、12周小鼠血清稀释80万~200万倍，52周小鼠血清稀释400万~800万倍用于IgG检测。血清总IgM、总IgG检测按照试剂盒说明书进行，每个稀释度的血清均采用2复孔进行检测。
2.4 血清抗-Gal IgG、IgM检测固相抗原包被板制备：取2 µg·mL-1的Gal-BSA溶液，每孔100 µL，添加至96孔酶标板中，室温低速摇动2 h，然后4 ℃过夜，洗板3次。每孔添加1%人血清白蛋白200 µL至96孔酶标板，并放入摇床中，37 ℃，100 r·min-1震摇2 h。洗板3次后直接使用或在4 ℃保存条件下1周内使用。血清样本制备：每只小鼠检测抗-Gal IgG的血清，用PBS进行2倍倍比稀释，配置从1:50~1:6 400的8个稀释样品。对用于检测抗-Gal IgM的小鼠血清，用PBS配制从1:100~1:12 800的8个稀释样品。同时设置参考血清（含抗-Gal IgG和抗-Gal IgM，另取Gal抗原缺失小鼠血清制备）并同法系列稀释[8]。在每块固相抗原包被的96孔酶标板上，加入系列稀释的待测试验小鼠血清和参考血清，每孔100 µL，每个稀释度2复孔。以PBS代替血清加入固相抗原包被孔作为空白孔。37 ℃，100 r·min-1，振摇反应2 h。洗板3次。采用PBS稀释酶标羊抗鼠IgG、IgM二抗抗体，均为32 000倍，分别加入测定抗-Gal IgG和抗-Gal IgM的固相抗原包被板中，每孔100 µL，37 ℃，100 r·min-1，反应1 h，洗板3次。固相抗原包被板每孔加入TMB显色液100 µL，避光反应15 min，然后每孔加入10%硫酸终止液100 µL，450 nm波长读取吸收度。
将参考血清抗-Gal IgG和抗-Gal IgM浓度实验室赋值为10 000 AU·mL-1和1 000 AU·mL-1。绘制每块固相抗原包被板参考血清稀释度和吸收度的线性回归曲线，每只待测试验小鼠用位于参考血清线性回归曲线范围内的血清稀释度和吸收度计算抗-Gal抗体浓度[9]。
2.5 血清细胞因子检测采用细胞因子微球检测技术（cytometric bead array，CBA）检测小鼠血清细胞因子IL-4、IL-10、IL-12p40和IFN-γ。按照试剂说明书，血清和细胞因子标准品在室温条件下与微球孵育1 h，然后加入荧光标记的抗体室温孵育2 h。洗涤后使用流式细胞仪检测微球样品荧光强度，CBA分析软件批量数据分析。
2.6 小鼠脾脏淋巴细胞亚型分析在“2.2”项取材时，小鼠经5%水合氯醛腹腔注射30 µL:10 g麻醉后，脱颈处死小鼠，浸泡于75%乙醇溶液消毒，在超净台内无菌取脾，将脾剪碎后转移至70 µm滤网，用注射器活塞末端研磨脾组织，用培养液冲洗，过滤收集并离心（1 000 r·min-1）5 min。离心后弃去上清液，加入红细胞裂解液3 mL，裂解5 min。再次离心并弃去上清液，加入PBS洗涤后重悬细胞，离心后制备成单细胞PBS悬液，计数后用PBS调节细胞浓度为1×107个·mL-1。
向各流式管中加入10 µL相应混合标记抗体，包括用于T淋巴细胞分型的CD45、CD3、CD4、CD8抗体，用于B淋巴细胞分型的CD45、CD3、CD19、CD69抗体，用于自然杀伤细胞（natural killer，NK）和自然杀伤T细胞（natural killer T cell，NKT）分型的CD45、CD3、CD49b、CD69抗体。取100 µL浓度为1×107个·mL-1的脾细胞悬液（1% BSA-PBS）加入各样本的流式管中，充分混合均匀，室温避光反应20 min。用2 mL 1% BSA-PBS离心（1 000 r·min-1）5 min洗涤2次。每管中加入1% BSA-PBS 0.5 mL重悬细胞后，避光放置待流式细胞仪检测，使用FACS DIVA SOFTWARE软件分析检测结果。
2.7 体外淋巴细胞增殖试验取分离获得的小鼠脾淋巴细胞，用含10%血清的1640培养液调整细胞悬液浓度为3×106个·mL-1。在96孔板上，每只小鼠脾淋巴细胞接种复孔，每孔接种200 μL细胞悬液，同时以只加200 μL细胞培养液的复孔作为吸收度值空白孔。将96孔板放入细胞培养箱，37 ℃、5% CO2培养3 d、7 d。在淋巴细胞培养结束前4 h，96孔板每孔加入20 μL的CCK8试剂，继续培养4 h后结束培养，使用酶标仪在450 nm处检测吸收度。
2.8 组织病理学评价每只小鼠取胸腺、脾脏以及包裹植入物的局部肌肉标本，经10%甲醛固定后，进行常规石蜡包埋组织学切片，切片HE染色后进行显微镜下组织病理学评价。植入物的组织学切片进行半定量的组织学评价，对多形核白细胞、淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、巨细胞等浸润细胞按局部镜下视野数量给予0~4记分，对坏死、新血管形成、纤维化、脂肪浸润等局部反应按镜下严重程度给予0~4记分。每只小鼠的植入物组织学评价总分为浸润细胞和局部反应的记分总和，每个试验组的植入物组织学评价记分为组内所有小鼠记分的平均值。记分平均值在0.0~2.9时显示植入物局部反应为无刺激；3.0~8.9时为轻微刺激；9.0~15.0时为中度刺激；> 15时为重度刺激[10]。
2.9 统计学分析试验计量资料用平均值±标准差表示，采用SPSS 21.0对正态分布、方差齐性的多组间数据进行单因素方差分析，选择与对照组比较的Dunnett法进行两两比较，P < 0.05时认为差异具有统计学显著性意义。
3 结果 3.1 血清总抗体检测结果小鼠血清总IgG、IgM含量检测结果如图 1所示，牛真皮基质原材料组（T1）、脱细胞真皮基质组（T2）的血清总IgG、IgM含量与对照组组比较均无统计学显著性差异（P > 0.05）。
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A.IgG含量（IgG content）B.IgM含量（IgM content） Con.对照组（control group）T1.真皮基质原材料组（raw material group of derma）T2.脱细胞真皮基质组（decellularized derma group） 图 1 小鼠血清总抗体含量 Fig.1 Total serum antibody in mice |
血清抗-Gal IgG、IgM检测结果见图 2。在植入后4周时，牛真皮基质原材料组（T1）血清抗-Gal IgG含量是对照组（Con组）的2倍（P < 0.05）；而脱细胞真皮基质组（T2）血清抗-Gal IgG含量与Con组相似，无统计学显著性差异（P > 0.05）。植入12周时T1组血清抗-Gal IgG含量平均值是对照组的近7倍（P < 0.01）；而T2组血清抗-Gal IgG含量平均值较对照组升高，但没有统计学显著性差异（P > 0.05）。在52周时，T1、T2组血清抗-Gal IgG含量与对照组相比均无统计学差异（P > 0.05）。
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A.anti-Gal IgG水平（IgG level）B.anti-Gal IgM水平（IgM level） Con.对照组（control group）T1.真皮基质原材料组（raw material group of derma）T2.脱细胞真皮基质组（decellularized derma group） 图 2 小鼠血清抗-Gal抗体 Fig.2 Serum anti-Gal antibody in mice |
在植入后4周时，对照组、T1组、T2组的血清抗-Gal IgM含量均无显著性差异（P > 0.05）。12周时，T1组、T2组的血清抗-Gal IgM含量平均值有升高，均为对照组的3倍左右，但均无统计学显著性差异（P > 0.05）。在52周时，T1、T2组血清抗-Gal IgM含量又都下降至对照组水平（P > 0.05）。
3.3 血清细胞因子检测结果如图 3显示，在植入后4、12、52周时，牛真皮基质原材料组（T1）和脱细胞真皮基质组（T2）的血清IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-12P40含量与对照组相比，均无统计学显著性差异（P > 0.05）。
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A.4周（4 weeks）B.12周（12 weeks）C.52周（52 weeks） Con.对照组（control group）T1.真皮基质原材料组（raw material group of derma）T2.脱细胞真皮基质组（decellularized derma group） 图 3 小鼠血清细胞因子 Fig.3 Serum cytokines concentration in mice |
在植入后4、12、52周时，T1组和T2组脾脏T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞等百分比与对照组相比，均无统计学显著性差异（P > 0.05，数据未给出）。
3.5 体外淋巴细胞增殖试验如图 4-A所示，植入后12周，取小鼠脾脏分离淋巴细胞进行体外淋巴细胞增殖试验，培养3、7 d的结果显示，T1组光吸收度与对照组相比均有统计学显著性差异（P < 0.05），T1组淋巴细胞增殖率分别是对照组的211%和243%；而T2光吸收度与对照组相比均无统计学显著性差异（P > 0.05）。
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A.12周（12 weeks）B.52周（52 weeks） Con.对照组（control group）T1.T1组（T1 group）T2.T2组（T2 group） 图 4 小鼠脾淋巴细胞增殖试验结果 Fig.4 The results of the mouse spleen lymphocytes proliferation test detected by CCK-8 |
如图 4-B所示，植入后52周，取小鼠脾脏分离淋巴细胞进行体外淋巴细胞增殖试验，培养3、7 d的结果显示，T1组和T2组光吸收度与对照组相比均无统计学显著性差异（P > 0.05）。
3.6 组织病理学评价在植入后的各个时间点，T1组和T2组的胸腺、脾脏组织病理学与对照组相比未有异常发现。
如图 5-A所示，T1组植入后4周组织学切片镜下见植入物周围见有增生的肉芽组织，重度浸润的炎性细胞，可见嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润，有的切片中可见少量多核巨细胞，组织学评价平均记分为21.4，组织学反应评级为重度刺激。植入后12周，镜下见植入物周围见有增生的纤维组织，植入物有轻度到中度的炎症细胞浸润，可见淋巴细胞、巨噬细胞浸润、偶见嗜酸性粒细胞。少数切片中可见不同程度的脂肪细胞增生，组织学评价平均记分为10.2，组织学反应评级为中度刺激。植入后52周，镜下见粉红染色的植入物内外见有轻度到中度的脂肪细胞增生，未见炎性细胞浸润，组织学评价平均记分为3.1，组织学反应评级为轻微刺激。
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A.T1真皮基质原材料组（raw material group of derma）B.T2脱细胞真皮基质组（decellularized derma group） 图 5 植入物局部组织病理学图片 Fig.5 Local histopathological images of implants |
如图 5-B所示，T2组在植入后4周局部反应中出现的炎症浸润细胞种类、组织反应类型与T1组相似，但浸润细胞数量和反应程度较T1组轻，组织学评价平均记分为11.9，组织学反应评级为中度刺激。12周时组织学评价平均记分为3.2，组织学反应评级为轻微刺激。52周时组织学评价平均记分为2.5，组织学反应评级为无刺激。在12周时，T2组多数小鼠组织切片中可见不同程度的脂肪细胞增生，在52周时，T2组多数小鼠组织切片中可见植入物已转化为脂肪组织或被脂肪组织替代。
4 小结和讨论本研究中牛脱细胞真皮基质制备方法[11]主要使用了氢氧化钠溶液和1% Triton-X100处理，用去热原水充分清洗，得到脱细胞真皮基质，干燥后包装，环氧乙烷灭菌后使用。试验中作为原材料对照的牛真皮基质未经氢氧化钠和Triton-X100处理环节，其他处置相同。
本研究采用了牛真皮基质原材料（T1组）作为用于评价脱细胞真皮基质免疫毒性风险的阳性对照，是为了确认实验所用Gal抗原缺失小鼠的反应敏感性。在各检测项目中，与对照组相比，T1组的材料特异性抗体血清抗-Gal IgG含量，以及实验小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖率具有统计学显著性差异，证明了所选择实验小鼠的敏感性。
在实验中发现，T1组Gal抗原缺失小鼠在植入4周时，血清抗-Gal IgG平均含量是对照组Con的2倍，植入12周时，血清抗-Gal IgG平均含量继续升高，达到对照组的近7倍，统计学分析均有显著性差异。而植入4周、12周的血清总IgG含量检测结果表明，T1组与对照组相比均无统计学显著性差异，表明对Gal抗原等特定的免疫原性物质，需检测其特异性抗体水平才能获得客观的信息。进一步分析组织病理学结果显示，植入4周时牛真皮基质表面及浅层出现炎性细胞浸润，表面出现虫噬状不规则改变，显示发生了降解。植入后12周与4周相比，牛真皮基质截面面积变小，显示发生了进一步的降解。结合牛真皮基质植入12周后的组织病理学发现和血清抗-Gal IgG含量检测结果，可推测由于降解引起的Gal抗原持续暴露或增加暴露，致使Gal抗原缺失小鼠血清抗-Gal IgG含量升高，表明对于可降解的动物源性生物材料，需要关注降解过程中引起的免疫反应的变化。
当把植入时间延长至52周时，T1组血清抗-Gal IgG平均含量回复到对照组水平，组织病理学观察还可见残留的牛真皮基质，但未见炎症细胞，可推测此时Gal抗原缺失小鼠可能对Gal抗原产生了免疫耐受，或者牛真皮基质残留Gal抗原不足以刺激Gal抗原缺失小鼠产生更高的特异性抗体变化，这还需要进一步研究来证实。
植入12周时，小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖试验显示，培养3 d、7 d时，T1组光吸收度与对照组相比均有统计学显著性差异（P < 0.05），T1组淋巴细胞增殖率分别是对照组的211%和243%。在植入12周的组织病理学显示，T1组可观察到有大量淋巴细胞浸润的现象，提示脾淋巴细胞体外明显增殖与牛真皮基质材料局部淋巴细胞浸润的关联性可以作为进一步的研究方向。
在本研究中，牛脱细胞真皮基质组（T2组）在4、12、52周的不同时间点上，检测的各项指标与对照组相比均无统计学差异，表明牛脱细胞真皮基质在这些方面的免疫风险显著降低，牛脱细胞真皮基质的降解也不会引起免疫反应的改变。Gal抗原缺失小鼠目前已应用在多种动物源性生物材料和产品的免疫原性评价试验中[7-8, 12-14]，其中抗-Gal抗体的检测是普遍进行的试验项目。但是目前没有商品化的可用于抗-Gal抗体定量的标准品，各实验研究中采用了不同的方法来表征抗-Gal抗体水平[14-17]，使各实验室间，甚至同一实验室内不同时间的抗-Gal抗体检测结果缺乏可比性。本研究参考文献建立了使用参考血清的相对定量方法，有助于横向比较可降解动物源性生物材料在不同时间点产生的抗-Gal抗体水平，也可用于研究不同动物源性生物材料残留Gal抗原与抗-Gal抗体水平的纵向比较。
在本研究中，T2组各时间点的抗-Gal IgG含量与对照组均无统计学显著性差异，但衡量抗-Gal IgG的实际含量可以发现在12周时，T2组抗-Gal IgG含量平均值是对照组的近5倍，由于组内变异大才未出现统计学差异。需要进一步分析组内Gal抗原缺失小鼠抗-Gal抗体水平差异大的原因，是由Gal抗原缺失小鼠对残留Gal抗原反应性不同造成的，还是其他实验因素的影响。对人体Gal抗体水平的研究表明，不同个体间Gal抗体水平差异较大[18]。本实验室近期开展的筛选预实验表明，同一批次小鼠兔血预免刺激后，抗-Gal抗体水平差距很大，且与小鼠体质量不相关。如果实验时仅按小鼠体质量进行随机分组，有出现组内抗-Gal抗体水平差距大及组间抗-Gal抗体水平不一致的情况，从而影响实验研究结果。因此，在着重评价动物源性生物材料和产品中残留Gal抗原引起的免疫反应的研究中，宜在实验开始时进行抗-Gal抗体基础水平筛选，在抗-Gal抗体水平匹配的情况下分组，才能在有限的动物数量下获得有效的实验结果。
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