2019, Vol. 39 
2. 中国人民解放军医学院, 北京 100853;
3. 中山大学, 广州 510275;
4. 四川省食品药品检验检测院, 成都 611731
2. Medical School of Chinese PLA, Beijing 100853, China;
3. Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China;
4. Sichuan Institute for Food and Drug Control, Chengdu 611731, China
临床上角膜疾病是第2位的致盲原因，角膜移植是角膜病致盲唯一有效的治疗方法[1-2]。但同种异体角膜供体缺乏，研发安全有效的异种角膜替代品无疑可很好地解决角膜供体不足的问题。除了角膜，结膜也是临床上眼科疾病的多发部位，眼部酸碱及热烧伤等均能对结膜组织造成不同程度的破坏，严重者可形成结膜瘢痕、睑球粘连[3]，导致瞬目障碍和眼球活动受限，严重影响视力。对于大面积结膜缺损的治疗，关键在于寻求足够面积的结膜替代物。
由哺乳动物细胞外基质制备的动物源性生物材料因来源充足，且具有良好的生物相容性，被广泛应用于创伤修复与组织重建等，其中脱细胞并去除抗原的异种角膜和结膜基质均有报道[4-6]，且大多取得了正面积极的研究结果。然而，动物源性生物材料的特殊风险需要严格控制，如细菌、霉菌、酵母菌、寄生虫、病毒、传播性海绵状脑病（TSE）等传染性因子污染，以及不希望的热原、免疫学或毒理学等方面的反应[7]。
α-半乳糖基抗原（α-1，3-galactosyle，α-Gal，简称Gal抗原）是最主要的异种抗原[4, 8-9]，因其广泛存在于牛、猪和其他低等动物体内，而人体及类人猿、旧世纪猴的半乳糖苷转移酶基因由于有2个碱基错位变异而不表达Gal抗原[10]，但在肠道菌群等的刺激下，人血清中存在高滴度的抗-Gal抗体（占总血清球蛋白的1%~3%）[11-13]，因此当人体移植含有Gal抗原的组织器官或残留有Gal抗原的脱细胞生物材料时会导致超急性免疫排斥反应或慢性免疫原性反应。因此，Gal抗原常被作为异种免疫原的指示抗原来评价动物源生物材料/医疗器械的免疫学风险。
由于野生型低等动物均表达Gal抗原，因此常规利用野生型低等动物无法科学客观地评价动物源性生物材料Gal抗原相关的免疫原性反应。如何科学客观地评价动物源性生物材料的免疫原性长期存在着瓶颈。本课题组自主研发了Gal抗原缺失（GGTA1 gene knockout）模式小鼠（中国食品药品检定研究院啮齿动物保种编号：GGTA1 KO-2014），并已成功用于心包来源的补片材料和异种骨基质等的免疫学评价[14-15]。但Gal抗原缺失小鼠早期体内抗-Gal抗体水平较低，远低于人体，为使Gal抗原缺失小鼠血清的抗-Gal抗体水平在实验开始时（8~9周龄）达到与人体接近的水平，更客观地评价动物源生物材料植入人体的免疫原性风险，本课题组及其他实验室的前期研究均显示试验开始前进行2次兔血红细胞（RRBC，含有丰富的Gal抗原）预免疫可有效提高小鼠体内的抗-Gal抗体水平且不引起明显的其他免疫毒理学反应[16-17]。综上，本研究拟利用经RRBC预免疫的Gal抗原缺失小鼠评价去细胞异种角膜基质和去细胞异种结膜基质的免疫原性风险。
1 实验材料 1.1 实验动物Gal抗原缺失（GGTA1基因敲除）小鼠，由本课题组研制，中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所模式动物室繁育。
1.2 材料与试剂小鼠IgG ELISA试剂盒（欣博盛公司，EMC116），小鼠IgM检测试剂盒（欣博盛公司，EMC129），羊抗鼠IgG-HRP（Abcam公司，ab6789），羊抗鼠IgM-HRP（Abcam公司，ab97230），Gal-BSA（Dextra Laboratories，3-Atom spacer，NGP0203），牛血清白蛋白（北京索莱宝公司，A8010），TMB（北京科悦达公司，SE1005），吐温-20（北京索莱宝公司，T8220），1640培养液（Gibco公司，批号11835-030），胎牛血清（Gibco公司，批号10099-141），细胞因子测试试剂盒（BD Biosciences公司，批号558296、560151、558298、558300），细胞表面抗体测试试剂盒（BioLegend公司，批号100305、100707、104507、103132、100412、115512、108910），磷酸盐缓冲液（PBS，Hyclone，SH30256.01B），红细胞裂解液（北京科悦达公司，KS801-100），70 μm细胞筛网（SPL Life Scineces，SPL-93070）。硫酸、水合氯醛、甲醛均购自国药集团化学试剂有限公司。
去细胞异种角膜基质的原材料为从猪眼球分离的角膜组织，去除表面的血液和脂肪后经生理盐水清洗后灭菌，保存在含人血清白蛋白的保存液中。角膜基质为经脱细胞等处理后，经生理盐水清洗后灭菌，保存在含人血清白蛋白的保存液中。原材料和基质样品呈圆片状，直径9.5~10.5 mm，厚度0.4~0.6 mm。
去细胞异种结膜基质及其原材料由北京拜欧生物科技有限公司提供。其中，原材料为从猪眼球分离的结膜组织，去除表面的血液和脂肪后经生理盐水清洗后干燥并灭菌。基质为经过脱细胞等工艺处理后干燥并灭菌。去细胞异种结膜基质为长方形片状，6 mm×10 mm；原材料为不规则片状。
1.3 主要仪器设备Spectramax M5酶标仪（MD公司），3k-15离心机（Sigma公司），HZQ-X100温箱（太仓豪诚公司），FA1104H十万分之一天平（上海民桥公司），FACSCanto TM Ⅱ流式细胞仪（BD公司），KD-BM生物组织包埋机（科迪公司），RM2016组织切片机（LEICA公司），DS-FI2组织切片成像系统（Nikon公司）。
2 实验方法 2.1 实验动物预免疫处理实验开始前（小鼠5~6周龄时）采用SPF级新西兰白兔血红细胞（RRBC）对小鼠进行预免疫刺激（共2次，间隔2周），每只小鼠每次腹腔注射约1×108个RRBC，第2次预免疫1周后植入样品。
2.2 样品植入及分组2种样品实验小鼠均分为对照组（Con）、原材料组（T1）和基质组（T2），每组6~8只动物，雌雄各半。由于角膜基质在体内降解较慢，将其植入小鼠腿部肌间隙内，而去细胞异种结膜基质降解较快，将其植入小鼠背部皮下。
去细胞异种角膜原材料组（T1）和基质组（T2）：在小鼠一侧腿部约1 cm切口内肌间隙植入样品，每只各0.25片（面积约0.8 cm2），对照组小鼠只进行手术操作，不植入任何材料。
去细胞异种结膜原材料组（T1）和基质组（T2）：在小鼠背部约1 cm切口内皮下植入样品，每只各0.6 cm2。对照组小鼠只进行手术操作，不植入任何材料。
2.3 取材去细胞异种角膜和结膜基质样品于植入1个月后取材，包括眼部取血（分离血清），摘取脾脏、胸腺、植入物及其周围组织，用于后续检测。
2.4 血清总IgG、IgM抗体检测按照小鼠IgG、IgM ELISA检测试剂盒的操作说明书进行检测。
2.5 血清抗Gal IgG、IgM抗体检测 2.5.1 包被96孔酶标板内每孔加入100 μL的Gal-BSA溶液（2 μg·mL-1），室温放置2 h，洗板5次。
2.5.2 封闭每孔加入200 μL 1% BSA溶液，封闭96孔酶标板，4 ℃过夜，洗板5次。
2.5.3 一抗反应每孔加入100 μL适度稀释（具体稀释倍数详见图 2~3）的血清，每只动物血清每个稀释度2复孔，37 ℃反应2 h，洗板5次。
2.5.4 二抗反应每孔加入100 μL适度稀释（具体稀释倍数详见图 2~3）HRP标记的羊抗鼠IgG、IgM抗体（IgG抗体16 000倍稀释，IgM抗体32 000倍稀释），37 ℃反应1 h，洗板5次。
2.5.5 显色每孔加入100 μL TMB显色液，37 ℃反应10~15 min后，每孔加入100 μL 10%硫酸，酶标仪450 nm处读取吸收度（A）。
2.6 血清细胞因子检测用CBA方法测定血清中细胞因子IL-4、IL-10、IL-12/IL-23p40、IFN-γ。具体步骤按照各试剂盒的操作说明书进行，采用流式细胞仪进行检测。
2.7 小鼠脾脏淋巴细胞亚型分析无菌环境中取出小鼠脾脏组织，研磨制备单细胞悬液，300 g离心5 min，弃上清，添加红细胞裂解液裂解红细胞10 min，加入完全细胞培养液终止裂解，300 g再次离心5 min，弃上清，加入适量PBS重悬细胞，调整细胞浓度至1×107个·mL-1
取100 μL调节好浓度的脾细胞悬液加入各样本的流式管，按各流式抗体说明书的最佳使用浓度，向各流式管中加入相应体积的抗体，充分混合均匀，室温避光反应20 min后，每管中加入PBS重悬细胞2 mL，300 g离心5 min，弃上清，每管中加入PBS 0.5 mL重悬细胞，避光放置待流式细胞仪检测。
2.8 小鼠胸腺、脾脏、植入物局部组织病理小鼠胸腺、脾脏、样品及其植入物局部组织取材后立即放入4%甲醛溶液中固定，然后进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，侵蜡，包埋，切片，再对切片进行脱蜡及HE染色等，最后中性树脂胶封固阅片。
2.9 统计学分析所得计量数据以mean±SD表示，采用SPSS软件对各组数据先进行正态分布及方差齐性检验，若各组数据均符合正态分布且方差齐则进行单因素方差分析；若有实验组数据不符合正态分布或方差不齐则进行非参数检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。
3 结果 3.1 血清总抗体检测结果去细胞异种角膜基质、去细胞异种结膜基质样品植入1个月后各组小鼠血清中总IgG、IgM抗体含量如图 1所示。由图 1-A可见，去细胞异种角膜基质样品植入1个月时，T1（原材料）组与T2（基质）组小鼠血清总IgG含量平均值均高于对照组，但各组间无显著性差异（P > 0.05）；T1（原材料）组与T2（基质）组小鼠血清总IgM含量平均值均低于对照组，但各组间无显著性差异（p > 0.05）。
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Con.对照组（control）T1.原材料组（raw materials）T2.基质组（matrix） A.去细胞异种角膜基质（acellular xenogeneic corneal matrix）B.去细胞异种结膜基质（acellular xenogeneic conjunctival matrix） 图 1 小鼠血清总抗体含量 Fig.1 Total antibody content in mice serum |
由图 1-B可见，去细胞异种结膜基质样品植入1个月时，T1（原材料）组与T2（基质）组小鼠血清总IgG、IgM含量平均值均高于对照组，但各组间无显著性差异（P > 0.05）。
3.2 血清抗-Gal抗体水平由于目前还没有小鼠特异性抗-Gal抗体标准品，所以无法进行抗-Gal抗体的定量检测。因此，仅以经各组小鼠血清稀释倍数校正后的抗体平均检测A值之比粗略分析升高或降低倍数，进行组间的对比分析。同时对相同稀释比例的不同组别的小鼠血清抗体水平进行统计学差异分析。
去细胞异种角膜基质及其原材料植入1个月后各组小鼠血清中抗-Gal抗体水平如图 2所示。与对照组相比，T1（原材料）组、T2（基质）组小鼠血清抗-Gal IgG、抗-Gal IgM抗体水平均无显著性差异（P > 0.05）。
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Con.对照组（control）T1.原材料组（raw materials）T2.基质组（matrix） A.抗-Gal IgG抗体（anti-Gal IgG）B.抗-Gal IgM抗体（anti-Gal IgM） 图 2 去细胞异种角膜基质小鼠血清抗Gal抗体水平 Fig.2 Anti-Gal antibody level of acellular xenogeneic corneal matrix in mice serum |
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Con.对照组（control）T1.原材料组（raw materials）T2.基质组（matrix） A.血清不同稀释比例抗-Gal IgG抗体（anti-Gal IgG）B.血清不同稀释比例抗-Gal IgM抗体（anti-Gal IgM）C.血清1：200稀释抗-Gal IgG抗体（anti-Gal IgG）D.血清1:200稀释抗-Gal IgM抗体（anti-Gal IgM） 图 3 去细胞异种结膜基质小鼠血清抗-Gal抗体水平（*P < 0.05，#P < 0.05） Fig.3 Anti-Gal antibody level of acellular xenogeneic conjunctival matrix in mice serum(*P < 0.05, #P < 0.05) |
去细胞异种角膜基质样品植入1个月各组小鼠血清中细胞因子含量均无显著性变化，各组间无显著性差异（P > 0.05，数据未提供）。
去细胞异种结膜基质样品植入1个月小鼠血清各细胞均无显著性变化，各组间无显著性差异（P > 0.05，数据未提供）。
3.4 脾脏淋巴细胞亚型分析去细胞异种角膜基质样品植入1个月后各组小鼠脾脏中T细胞、B细胞和NK细胞表面表达不同分子的各种亚型占总淋巴细胞比例的检测结果显示：各组淋巴细胞亚型表面分子的表达水平与对照组均无显著性差异（P > 0.05，数据未提供）。
去细胞异种结膜基质植入1个月后各组小鼠脾脏中T细胞、B细胞和NK细胞表面表达不同分子的各种亚型占总淋巴细胞比例的检测结果如图 4所示。
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Con.对照组（control）T1.原材料组（raw materials）T2.基质组（matrix） A.T淋巴细胞表面分子（T lymphocyte marker level）B.B淋巴细胞表面分子（B lymphocyte marker level）C.NK淋巴细胞表面分子（NK lymphocyte marker level）。 *.T1组与Con组均值比较P < 0.05（P < 0.05，T1 compared with Con）#.T2组与Con组均值比较P < 0.05（P < 0.05，T2 compared with Con） 图 4 去细胞异种结膜基质小鼠脾脏淋巴细胞亚型分析 Fig.4 Analysis of splenic lymphocyte subtypes for acellular xenogeneic conjunctival matrix in mice |
由图 4可见，样品植入1个月时，与对照组相比，T1（原材料）组小鼠脾脏T细胞表面分子CD3+CD8+表达水平显著升高（P < 0.05）；T2（基质）组小鼠脾脏T细胞表面分子CD3+CD8+、CD3+ CD69+，以及NK细胞表面分子CD3-CD49b+表达水平均显著升高（P < 0.05），但均在对照组历史数据变异范围内。T1（原材料）组、T2（基质）组小鼠脾脏的其他表面分子表达水平，与对照组相比均无显著性差异（P > 0.05）。
3.5 胸腺、脾脏、样品及其植入局部组织病理去细胞异种角膜基质、去细胞异种结膜基质样品植入1个月后，各组小鼠脾脏、胸腺均未见异常，样品及其植入局部组织病理见图 5~6。
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Con.对照组（control）T1.原材料组（raw materials）T2.基质组（matrix） 图 5 去细胞异种角膜基质植入局部组织病理 Fig.5 The local tissue pathology results of acellular xenogeneic corneal matrix |
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Con.对照组（control）T1.原材料组（raw materials）T2.基质组（matrix） 图 6 去细胞异种结膜基质植入局部组织病理 Fig.6 The local tissue pathology results of acellular xenogeneic conjunctival matrix |
如图 5所示，去细胞异种角膜基质样品植入1个月后，T1（原材料）组和T2（基质）组腿部肌肉切片中横纹肌组织内均可见植入物。植入物边缘部内可见有炎性细胞浸润，植入物边缘部中可见有纤维细胞长入，植入物中央部由于炎性细胞尚未浸润并且纤维细胞未长入，故呈均一的深粉红色。植入物周围见有增生的肉芽组织，见有中度到重度的炎症细胞浸润，可见嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润，偶见多核巨细胞。外周可见不同程度的纤维组织增生。参照GB/T16886.6-2015，植入1个月时，T1（原材料）组和T2（基质）组植入局部组织学反应均为重度刺激反应；炎症分级均为Ⅲ级。
如图 6所示，去细胞异种结膜基质样品植入1个月后，T1（原材料）组小鼠皮下无材料残留，样品植入局部组织学反应为无刺激反应，T2（基质）组在皮下植入1个月后仍有材料残留，样品植入局部组织学反应为轻微刺激反应。
4 讨论与结论本文研究的去细胞异种角膜基质，以新鲜猪角膜为原料，由前弹力层和基质层组成，主要成分为胶原类细胞外基质；去细胞异种结膜基质同样来源于猪，是猪结膜的细胞外基质，由天然结膜的纤维层和结膜下组织构成，主要成分也是胶原蛋白。
角膜因其没有血管，具有较低的免疫原性（角膜原材料Gal抗原含量约4.3×1013·mL-1，湿重），被认为是免疫豁免的器官。有研究显示，角膜不同层组织之间比较，角膜内皮免疫原性最强，角膜基质免疫原性最弱[18]。而且，猪角膜基质在常见的动物角膜基质中免疫原性最低[19]，其原因可能是猪角膜相比其他常见动物角膜，蛋白质的氨基酸序列、等电点等特性更接近人角膜[20]。然而，有研究报道应用Gal抗原缺失小鼠，评价角膜组织原材料的免疫原性反应时仍能观察到其局部特异性抗体、细胞因子等免疫因子的沉积和聚集，影响组织的再生和重建；而脱细胞异种角膜基质局部免疫反应显著降低[4]。本研究使用的去细胞异种角膜基质样品虽然没有观察到全身性免疫反应征象，但植入物局部的组织学反应比较重，样品植入1个月原材料和基质组均为重度刺激反应（炎症反应Ⅲ级）。分析其原因，样品保存液中含有人源白蛋白成分，样品中残留的白蛋白有可能在实验小鼠体内引起人-鼠的异种免疫反应和非特异性炎症反应，此种可能有待于进一步验证和分析。由于原材料组和脱细胞异种角膜基质组具有同等程度的炎症反应，因此可能不是脱细胞工艺中的化学试剂残留所致。
角膜基质的降解较慢，本研究选择的植入后1个月时间点时，样品基本没有明显降解，基质中本来抗原成分较低，又没有得到充分的暴露，因此没有观察到特异性免疫反应征象。根据本实验室数据，异种去细胞心包类基质大约在样品植入3个月左右开始发生降解，抗原得到大量释放，利用Gal抗原缺失小鼠能够观察到特异性免疫反应（如特异性抗Gal抗体的升高等）。因此，对于可降解性动物源性材料，特别是膜类材料，需要根据材料的降解特性合理地设计观察终点，涵盖降解初期，降解高峰期和平稳期的全降解周期，并选择合适的动物模型进行评价，才能客观地反映其免疫原性风险。
去细胞异种结膜基质样品降解较快，在植入1个月时大部分已降解，有少量材料残留，此时观察到了接近最大的免疫毒理学反应；而原材料组已全部降解，无材料残留，推测其最大的免疫毒理学反应可能发生在植入后2周左右。随着材料的不断降解，其中残留的异种抗原，如：Gal抗原（结膜原材料Gal抗原含量约1.5×1016·mL-1（干重），去细胞异种结膜基质Gal抗原含量约1.85×1013·mL-1（干重））得以充分暴露，进而引起小鼠血清中的抗-Gal IgG、抗-Gal IgM抗体水平显著升高。去细胞异种结膜基质组小鼠的特异性抗体水平与原材料组相比并没有明显降低，其原因可能与材料降解情况不同而呈现的最大反应时期不同有关。原材料组在植入后4周时已经没有材料残留，说明降解产物最多的时期发生在更早的时间，最大免疫毒理学反应也发生在更早期。在本实验室的后续研究中，去细胞异种结膜基质在植入3个月时，随着材料的完全降解和新生组织的再生，特异性抗-Gal抗体水平回复正常。综上所述，本研究的结果证实了本课题组研制的Gal抗原缺失小鼠对材料中残留Gal抗原的敏感性，应用Gal抗原缺失小鼠能够科学地评价动物源性生物材料的异种免疫原性风险。
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