2019, Vol. 39 
2. 西南交通大学 材料科学与工程学院, 成都 611756
2. School of Materials Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 611756, China
淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段，检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究和临床免疫功能检测的一种常用方法。抗原刺激淋巴细胞产生各种细胞因子或白介素，这些细胞因子或白介素将激活并刺激淋巴细胞分化，从而使增殖反应放大。T细胞受特异性抗原或非特异性有丝分裂原（如刀豆球蛋白A，Con A）刺激后，细胞代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应，并转化为淋巴母细胞，进而影响机体内的免疫应答（包括刺激效应与抑制效应）。
α-半乳糖基抗原（Gal抗原）是动物组织、器官引起超急性免疫排斥反应中的主要靶抗原[1-2]，广泛存在于牛、猪和其他低等动物体内。人体由于有2个碱基错位变异而不表达Gal抗原[3]，但人血清中存在高滴度的抗-Gal抗体（占总血清球蛋白的1%~3%）[4-6]，因此当人体接受含有Gal抗原的组织、器官，或残留有Gal抗原的脱细胞生物材料时，Gal抗原就会与人体中的抗-Gal IgG等结合激活补体，引起补体介导的抗体依赖型细胞毒性效应，最终导致植入失败[7]。目前，关于动物源性生物材料中残留Gal抗原是否与淋巴细胞增殖效应存在一定的相关性，参与了细胞免疫仍未见报道。
本研究首先对人外周血淋巴细胞增殖试验条件进行优化，然后采用优化后的试验条件对动物源性生物材料（胶原蛋白海绵及其原材料牛跟腱）与淋巴细胞进行共培养，考察2种材料对人外周血淋巴细胞增殖能力的差异，从而阐明动物源性生物材料中残留Gal抗原是否与淋巴细胞增殖效应存在一定的相关性。由于人体不含Gal抗原，而小鼠体内含有Gal抗原，为考察人外周血淋巴细胞是否对含Gal抗原动物源性生物材料的细胞免疫特异性和敏感性更好，本研究采用小鼠脾脏淋巴细胞与胶原蛋白海绵或牛跟腱共培养，考察2种材料对小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力的影响，从而综合比较2种材料对不同种属来源淋巴细胞的增殖效应敏感性的差异。
1 材料 1.1 试验样品牛跟腱[规格：0.5×1×1.36（cm）]、胶原蛋白海绵[规格：5×2.5×0.5（cm）]均常温保存，由合作单位提供，其中胶原蛋白海绵由牛跟腱制备而来。
1.2 试剂与耗材1640培养液（Gibco公司，批号8118134），胎牛血清（Gibco公司，批号10091-148），青链霉素双抗（北京索莱宝科技有限公司，批号20171206），刀豆球蛋白A（北京欣经科生物技术有限公司，批号11028-71-0），人外周血淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，批号20170705-1549），CCK-8试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号503Q011），96孔细胞培养板（Costar，批号32716601），Gal抗原定量检测试剂盒（北京三药科技开发公司，批号20180308），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术，批号070618180905）。
1.3 主要设备Spectramax M5酶标仪（MD公司），3K-15离心机（Sigma公司），BB150二氧化碳培养箱（Thermo公司），CKX41倒置显微镜（Olympus公司），HZQ-X100恒温摇床（太仓豪诚公司），JXFSTPRP-CL冷冻研磨仪（上海净信公司）。
2 方法 2.1 标准曲线的建立采集健康人肘静脉血50 mL，分别加入装有等体积（每管5 mL）的人外周血淋巴细胞分离液的离心管中，1 200 r·min-1离心15 min。离心结束后，小心吸取中间云雾层细胞到新离心管中，然后1 200 r·min-1离心5 min，去上清，加入完全细胞培养液，吹打混匀，将细胞悬液从原液倍比稀释9个梯度。将100 µL不同浓度的淋巴细胞接种于96孔细胞培养板，设置1排孔作为无细胞加样对照。每孔添加100 µL细胞培养液与20 µL CCK8。在37 ℃、5% CO2条件下反应5 h，在450 nm处读取吸收度。
2.2 试验条件优化 2.2.1 阳性对照制备选择刀Con A作为本实验的阳性对照。采用完全细胞培养液（含10%胎牛血清，1%双抗）为介质，稀释500 µg·mL-1 Con A母液得到20、10、5 µg·mL-1的Con A工作液。
2.2.2 人外周血淋巴细胞接种和检测参照“2.1”项下方法，配制浓度为4×106、2×106、1×106个·mL-1的细胞悬液。将100 µL不同浓度的淋巴细胞接种于96孔细胞培养板，设置1排孔作为无细胞加样对照。每孔添加100 µL细胞培养液。在37 ℃、5% CO2条件下分别培养3 d与4 d。培养结束后，每孔加入20 µL CCK8，在37 ℃、5% CO2条件下反应5 h，在450 nm处读取吸收度。
2.3 考察样品的淋巴细胞增殖效应 2.3.1 样品制备匀浆液：取胶原蛋白海绵（或牛跟腱）12 cm2，在超净工作台中剪成约1 mm2大小，转移到无菌EP管，加入灭菌钢珠和1 mL无血清细胞培养液。在冷冻研磨仪中匀浆，然后5 000 r·min-1离心8 min，取上清，用无血清细胞培养液定容到2 mL。
浸提液：按照6 cm2·mL-1的浸提比例，将胶原蛋白海绵浸泡到无血清细胞培养液中，37 ℃浸提72 h。
淋巴细胞：参照“2.1”项下方法制备人外周血淋巴细胞悬液，配制最佳细胞接种密度，每孔接种体积为100 µL。
2.3.2 试验样品与细胞共培养及细胞增殖率检测根据预试验结果，高蛋白浓度的样品匀浆液原液对试验体系产生显著的干扰，造成原因不明的淋巴细胞增殖抑制作用，因此，本实验选择用无血清细胞培养液5倍稀释作为匀浆液的高剂量组。在96孔板中添加不同组别试验样品，1）高剂量匀浆组（胶原蛋白海绵或牛跟腱）：在匀浆液中添加10% FBS与1%双抗，稀释5倍后制备供试液，每孔添加100 µL；2）低剂量匀浆组（胶原蛋白海绵或牛跟腱）：在匀浆液中添加10%FBS与1%双抗，稀释50倍后制备供试液，每孔添加100 µL；3）胶原蛋白海绵浸提液组：在浸提液中添加10% FBS与1%双抗，每孔添加浸提液原液100 µL；4）胶原蛋白海绵浸提液稀释组：在浸提液中添加10% FBS与1%双抗，稀释5倍制备供试液，每孔添加100 µL；5）细胞对照组：每孔添加100 µL完全细胞培养液；6）阳性对照组：每孔加入100 µL的10 µg·mL-1 Con A。将96孔细胞培养板在37 ℃、5% CO2条件下培养4 d。
细胞增殖率检测：每孔加入20 µL CCK8，在37 ℃、5% CO2条件下反应5 h，在450 nm处读取吸收度。
2.4 小鼠脾脏淋巴细胞增殖试验参考标准YY/T 1465.1-2016，对“2.3.1”与“2.3.2”中制备的匀浆液与浸提液进行BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞增殖试验。
2.5 Gal抗原含量检测参照Gal抗原定量检测试剂盒说明书，对“2.3.1”与“2.3.2”项中制备的匀浆液与浸提液进行Gal抗原含量检测。
2.6 统计学分析采用SPSS 20.0中单因素方差分析比较各试验组的淋巴细胞增殖水平、Gal抗原含量及蛋白质含量差异；当P < 0.05时，判定为有统计学差异。
3 结果 3.1 标准曲线如图 1所示，每孔细胞接种量在2.6×105~ 3.375×105时，吸收度（A）处于0.05~2.0，R2可达到0.997，线性较好。
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图 1 细胞接种数与A值的拟合标准曲线图 Fig.1 The standard fitting curve of cell seeding number and A value |
由表 1可见，细胞培养3 d时，当每孔细胞接种数为4×105时，细胞对照组A值过高；阳性对照组（Con A）的细胞培养所需营养不够，未出现明显增殖。当每孔细胞接种数为2×105时，阳性对照组（Con A）的细胞培养所需营养不够，未出现明显增殖。当每孔细胞接种数为1×105时，阳性对照组（Con A）的淋巴细胞增殖呈现剂量-效应关系。
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表 1 不同细胞接种量与Con A浓度时人外周血淋巴细胞增殖结果（培养3 d，n=3） Tab.1 The results of human peripheral blood lymphocytes proliferation under different cell seeding numbers and Con A concentration (after 3 d culture) |
细胞培养4 d的结果见表 2。当每孔细胞接种数为4×105时，阳性对照组（Con A）的细胞培养所需营养明显不够，未出现增殖。当每孔细胞接种数为2×105时，阳性对照组（Con A）的细胞出现明显增殖，其中2.5 µg·mL-1 Con A组的增殖率最高。当每孔细胞接种数为1×105时，阳性对照组（Con A）的淋巴细胞增殖呈现剂量-效应关系。当每孔细胞接种数为1×105时，与培养3 d相比，培养4 d后的Con A组增殖效应更明显。因此，本试验优化后的条件：每孔细胞接种数为1×105，Con A的质量浓度可为5~10 µg·mL-1，细胞培养时间为4 d。
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表 2 不同细胞接种数与Con A浓度时人外周血淋巴细胞增殖结果（培养4 d，n=3） Tab.2 The results of human peripheral blood lymphocytes proliferation under different cell seeding numbers and Con A concentration (after 4 d culture) |
样品淋巴细胞增殖效应的检测结果见表 3、表 4，阳性对照组（Con A）的细胞增殖率为369.7%或441.96%，与细胞对照组相比，呈现明显增殖效应，表明试验体系成立。如表 3所示，高、低剂量胶原蛋白海绵匀浆组的淋巴细胞增殖率分别为93.94%与96.97%，其OD值与正常细胞对照组相比均无显著性差异（P > 0.05）；胶原蛋白海绵浸提液组与浸提液5倍稀释组的淋巴细胞增殖率分别为90.32%与93.55%，其A值与正常细胞对照组相比均无显著性差异（P > 0.05）。牛跟腱匀浆液5倍稀释组淋巴细胞增殖率为75.48%，其A值与正常细胞对照组相比存在显著性差异（P < 0.05）；牛跟腱匀浆液50倍稀释组淋巴细胞增殖率为90.49%，其A值与正常细胞对照组相比不存在显著性差异（P > 0.05）。
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表 3 胶原蛋白海绵匀浆液或浸提液添加后人外周血淋巴细胞增殖率 Tab.3 Human peripheral blood lymphocyte proliferation rate under homogenate or extraction of collagen sponge administration |
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表 4 牛跟腱匀浆液添加后人外周血淋巴细胞增殖率 Tab.4 Human peripheral blood lymphocyte proliferation rate under homogenate of bovine tendon administration |
如表 5所示，胶原蛋白海绵的匀浆液与浸提液对小鼠脾脏淋巴细胞均无明显增殖效应。而牛跟腱匀浆液5倍稀释组与50倍稀释组对小鼠脾脏淋巴细胞均有明显增殖效应；100倍稀释组对小鼠脾脏淋巴细胞无明显增殖效应。
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表 5 不同试验样品处理后小鼠脾脏淋巴细胞增殖率（%） Tab.5 Mouse spleen lymphocyte proliferation rate under different test sample adminstration |
如图 2所示，牛跟腱匀浆液的Gal抗原含量高于胶原蛋白海绵匀浆液与浸提液，其中牛跟腱匀浆液与胶原蛋白海绵浸提液的Gal抗原含量存在显著性差异（P=0.04）；胶原蛋白海绵浸提液与胶原蛋白海绵匀浆液的Gal抗原含量不存在显著性差异。
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BTH.牛跟腱匀浆液（bovine tendon homogenate）CSH.胶原蛋白海绵匀浆液（collagen sponge homogenate）CSE.胶原蛋白海绵浸提液（collagen sponge extraction） 图 2 Gal抗原含量检测结果 Fig.2 Results of Gal antigen content determination |
在研究早期，大多采用MTT法研究药物对淋巴细胞增殖试验的影响[8-10]。MTT法的检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶（甲臜）并沉积在细胞中，二甲基亚砜能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在570 nm波长处测定其吸收度A值，可间接反映活细胞数量。当采用悬浮生长的淋巴细胞来考察受试物的增殖效应时，由于加入二甲基亚砜之前吸出上清液时可能带走部分细胞，导致出现试验误差较大，重复性差等问题。CCK-8法的原理与MTT法相同，但四唑盐（WST-8）还原后可生成高度可溶性的黄色结晶，可直接进行比色，生成的结晶量与活细胞数量呈正比，操作简单，误差小。目前，CCK-8法在医药领域已经得到广泛的应用[11-13]。
本研究利用CCK-8细胞活性检测法，优化了基于人源外周血淋巴细胞的淋巴细胞增殖试验条件。由于所有低等动物体内均表达Gal抗原，而人体内不表达Gal抗原，为考察人源细胞试验体系是否比动物来源的细胞试验体系对含有Gal抗原的动物原材料具有更高的敏感性，本研究进行了人源外周血淋巴细胞和小鼠脾脏淋巴细胞增殖试验的对比研究。在优化的人源外周血淋巴细胞增殖试验体系中，牛跟腱组织及其由牛跟腱提取的胶原蛋白制备而成的胶原蛋白海绵均显示没有显著影响。虽然牛跟腱匀浆液5倍稀释组的淋巴细胞增殖率为75.48%，分析其原因可能与匀浆液中蛋白浓度过高而导致干扰了试验体系，具体原因还需要进一步验证。在小鼠脾脏淋巴细胞增殖试验中，胶原蛋白海绵的匀浆液与浸提液对小鼠脾脏淋巴细胞均无明显影响。而牛跟腱匀浆液5倍稀释组与50倍稀释组对小鼠脾脏淋巴细胞均有明显增殖效应。这些结果提示，人源外周血淋巴细胞增殖试验在评价牛跟腱类动物源材料时，与小鼠脾脏淋巴细胞增殖试验相比没有显示出更高的灵敏性。
为进一步考察Gal抗原对淋巴细胞增殖的影响，采用不同样品前处理方式，即：胶原蛋白海绵的匀浆液（使其残留的Gal抗原充分暴露）和浸提液对比，匀浆液Gal抗原含量高于浸提液，但是对人外周血淋巴细胞或者小鼠脾脏淋巴细胞的增殖均没有显著影响。因此，Gal抗原含量与淋巴细胞增殖效应似乎不存在正向相关性。这一现象可以解释为：人体内存在高滴度的抗-Gal抗体[4-6]，与动物源性生物材料残留Gal抗原引起的免疫反应以体液免疫为主，与细胞免疫应答相关性不强。理论上，可将纯化后的Gal抗原作为研究对象来考察对淋巴细胞增殖的剂量-效应关系。可是，目前市售的人工合成的Gal抗原（Gal-BSA）中含有BSA成分，并不是合适的研究对象（BSA本身也具有免疫原性）。另外，本课题组针对牛心包、猪心包与猪角膜等典型动物源性生物材料中是否也出现此类现象正在进一步研究中。
采用BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞评价材料（胶原蛋白海绵及其原材料牛跟腱）的淋巴细胞增殖效应的结果显示，胶原蛋白海绵的匀浆液对小鼠脾脏淋巴细胞无明显增殖效应，而牛跟腱匀浆液5倍稀释组与50倍稀释组，对小鼠脾脏淋巴细胞均有明显增殖效应，且具有剂量-效应关系，这一结果提示，在样品匀浆处理条件下，胶原蛋白海绵的免疫原性与其原材料牛跟腱组织相比显著降低。
体外淋巴细胞增殖试验是评价动物源性生物材料引起细胞免疫风险的可用手段之一。由于该试验受多种试验条件的影响，建议每个实验室应建立优化的试验条件，关注不同种属淋巴细胞来源的差异和样品前处理方式的不同对结果的影响。虽然本研究中采用人外周血淋巴细胞评价牛跟腱动物源性生物材料增殖效应的敏感性未见优势；与采用小鼠脾脏作为淋巴细胞来源相比，采用人外周血作为淋巴细胞来源显得实验成本更高，细胞来源不方便及试验操作难度更高；但理论上选择人外周血淋巴细胞能客观反映医疗器械的临床实际应用风险，可反映动物源性生物材料中异种抗原（非Gal抗原类）引起的细胞免疫反应。
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