动物源性生物材料经脱细胞工艺处理后保留着细胞外基质组成成分和结构，在组织修复重建方面的作用得到广泛研究。作为异种生物来源的外科植入物，该类材料在宿主引起的免疫反应也成为其生物相容性和组织修复重建功能评价中不可缺少的关键内容^[1]。淋巴细胞增殖试验，也被称为T淋巴细胞转化试验，作为一种可反映免疫细胞功能的试验方法已得到广泛应用^[2]。医疗器械行业标准YY/T 0606.15-2014推荐淋巴细胞增殖试验作为评价组织工程医疗产品基质或支架细胞免疫反应的一种方法^[3]，在该标准中未限定使用的动物种属；而在YY/T 1465.1-2016 《医疗器械免疫原性评价方法第1部分：体外T淋巴细胞转化试验》中推荐可用BALB/c小鼠进行体外淋巴细胞增殖试验^[4]。

动物源性生物材料一般来自于猪、牛等动物，这些动物一般均表达Gal抗原^[5]，虽然经过了脱细胞工艺处理，但残留Gal抗原仍然是需要评价的免疫学风险^[6-7]。BALB/c小鼠自身表达Gal抗原，因此可能不适用于与Gal抗原相关的风险评价。C57BL/6（简称C57）小鼠遗传背景清晰，通过基因编辑敲除Gal抗原的主要调控基因GGTA1，获得Gal抗原缺失的C57（GGTA1KO）小鼠，已在动物源性生物材料的免疫原性评价中得到重要应用^[8-9]。

体外淋巴细胞增殖试验受众多因素影响，如淋巴细胞来源的动物种属等。有研究发现不同种属来源的淋巴细胞对Con A等有丝分裂原的增殖反应存在种属差异^[10]。淋巴细胞增殖的检测方法也影响其他试验条件的选择^[11]。现在已有多种非放射性试剂用于淋巴细胞增殖检测，例如5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）^[12]、阿尔玛蓝（Alamar Blue）^[13]、噻唑蓝（MTT）、CCK8试剂盒^[14]等，研究发现对于相同数量细胞的培养体系，CCK8法灵敏度要高于MTT法^[15]。因此，本研究采用CCK8检测淋巴细胞增殖，对BALB/c小鼠与C57小鼠、野生型C57小鼠与Gal抗原缺失C57小鼠的体外淋巴细胞增殖试验开展了比较研究。

7~8周龄洁净（SPF）级BALB/c小鼠、C57BL/6（C57）小鼠、Gal抗原缺失（C57背景，GGTA1基因被敲出）小鼠由本课题组研制，由中国食品药品检定研究院实验动物资源所繁育。牛心包原材料由广东冠昊生物科技股份有限公司提供。胎牛血清、RPMI-1640细胞培养液（Gibco公司），青链霉素混合液、CCK8试剂盒（北京索莱宝），刀豆蛋白A（北京欣经科公司），红细胞裂解液（科瑞达），70 μm细胞筛网（SPL公司），96孔细胞培养板（Costar）。Spectramax M5酶标仪（MD公司），FACSCanto II流式细胞分析仪（BD公司），JXFSTPRP-CL冷冻研磨仪（上海净信公司），BB150二氧化碳培养箱（Thermo公司），T-60R振荡培养箱（旻全公司），CKX41倒置显微镜（Olympus公司），3K-15离心机（Sigma公司）。

小鼠经5%水合氯醛腹腔注射（30 μL:10 g）麻醉后，脱颈处死小鼠，浸泡于75%乙醇溶液消毒，在超净台内无菌取脾，将脾剪碎后转移至滤网，用注射器活塞末端研磨脾组织，用培养液冲洗，过滤收集滤液并离心（1 000 r·min^-1）5 min。离心后弃去上清液，加入红细胞裂解液3 mL裂解。再次离心（1 000 r·min^-1）5 min并弃去上清液，加入培养液洗涤后重悬细胞，离心后制备成单细胞悬液，计数后使用。

取7~8周龄的雌性C57小鼠和BALB/c小鼠，分离获得新鲜脾脏淋巴细胞，2倍倍比稀释到指定浓度，每个浓度设5个复孔，每孔加200 μL对应浓度细胞悬液，并设5孔不含细胞的完全培养液作为空白对照。每孔加入20 μL CCK8后在37 ℃、5%CO₂条件下孵育4 h，用酶标仪检测450 nm波长的吸收度。

分别将胶原蛋白海绵、胶原蛋白海绵的原材料牛跟腱剪切为1~2 mm的细颗粒状物，在匀浆管中按6 cm²·mL^-1的比例加入无血清培养液（含1%青霉素-链霉素双抗），在冷冻研磨仪中匀浆（4℃，65 Hz，4 min），匀浆液离心后取上清液加入10%血清后作为匀浆液原液用于试验，匀浆液稀释液用完全培养液（10%血清+1%双抗培养液）稀释。

脾淋巴细胞增殖试验中设置空白对照组、细胞阴性对照组、Con A阳性对照组、不同浓度的胶原蛋白海绵匀浆液组和牛跟腱匀浆液组。将C57小鼠脾淋巴细胞悬液稀释为6×10⁶个·mL^-1后接种96孔板，每孔100 μL；空白对照孔加入不含细胞的完全培养液100 μL。然后Con A阳性对照组加入含5 μg·mL^-1Con A的完全培养液100 μL（Con A终浓度2.5 μg·mL^-1），匀浆液组分别加入未稀释、5倍稀释、25倍稀释的胶原蛋白海绵匀浆液或牛跟腱匀浆液100 μL，细胞阴性对照组、空白对照组均加入完全培养液100 μL。参考YY/T 1465.1-2016^[3]中建议浓度，BALB/c小鼠脾淋巴细胞悬液稀释为4×10⁶个·mL^-1后接种96孔板，每孔100 μL，然后空白、阴性、阳性对照组各加入相应溶液100 μL，胶原蛋白海绵匀浆液组分别加入5倍、50倍匀浆稀释液，牛跟腱匀浆液组分别加入5、50、100倍匀浆稀释液。在培养箱中37 ℃、5%CO₂条件下培养68 h，96孔板每孔加入20 μL CCK8后再孵育4 h，用酶标仪检测450 nm波长的吸收度。

将牛心包组织（原材料）剪切为1~2 mm的细颗粒状物，按6 cm²·mL^-1的比例加入无血清培养液（含1%双抗），在冷冻研磨仪中匀浆（4 ℃，65 Hz，4 min），匀浆液离心（8 000 r·min^-1）5 min后取上清液加入10%血清后作为匀浆液原液用于试验，匀浆液稀释液用完全培养液稀释。

分离获取7~8周龄的雌性野生型和Gal抗原缺失C57小鼠新鲜脾脏淋巴细胞。脾淋巴细胞增殖试验设计同前，包括空白、阴性、2.5 μg·mL^-1Con A阳性对照组，不同浓度的牛心包匀浆液组。将小鼠脾淋巴细胞悬液稀释为6×10⁶个·mL^-1后接种96孔板，每孔100 μL；然后空白、阴性、阳性对照组各加入相应溶液100 μL，牛心包匀浆液组分别加入未稀释，5、20倍匀浆稀释液。在培养箱中37 ℃、5%CO₂条件下培养72 h后，用酶标仪检测加入CCK8试剂反应后的450 nm波长吸收度。

在野生型C57和Gal抗原缺失小鼠的脾淋巴细胞增殖比较试验中，将96孔板每孔细胞吹打混匀后，吸出淋巴细胞悬液至微量离心管，离心（1 000 r·min^-1）5 min后去除上清液，加入1% BSA-PBS 0.5 mL重新悬浮成单细胞悬液。各单细胞悬液取3份100 μL液体分别加入10 μL不同CD组合抗体，用于T淋巴细胞分型的CD45、CD3、CD4、CD8抗体，用于B淋巴细胞分型的CD45、CD3、CD19、CD69抗体，用于自然杀伤细胞（natural killer，NK）和自然杀伤T细胞（natural killer T cell，NKT）分型的CD45、CD3、CD49_b、CD69抗体。室温避光孵育20 min后，用1% BSA-PBS 2 mL离心洗涤2次，加入1% BSA-PBS 0.5 mL制备成单细胞悬液，在流式细胞仪上检测，使用FACS DIVA SOFTWARE软件分析检测结果。

试验计量资料用平均值±标准差表示，采用SPSS 21.0对正态分布、方差齐性的多组间数据进行单因素方差分析，选择与对照组比较的Dunnett法进行两两比较，P < 0.05时认为差异具有统计学显著性意义。

在淋巴细胞增殖试验中，加入CCK8后孵育产物的吸收度A_{450 nm}应与细胞数量成线性关系。从图 1可见，CCK8检测可接受的C57小鼠脾淋巴细胞数量线性范围上限是每孔20×10⁵个细胞；而对BALB/c小鼠而言，可接受的线性范围上限是每孔6.75×10⁵个细胞。一般而言线性范围越宽，表明能允许检测出的差异范围更大。另一方面，BALB/c小鼠线性曲线的斜率明显大于C57小鼠，表明BALB/c小鼠脾淋巴细胞数量变化引起的吸收度绝对值的改变将更为明显。

图 1 CCK8非线性拟合线和线性检测范围 Fig.1 CCK8 nonlinear fitting line and linear detection range.

C57和BALB/c小鼠脾淋巴细胞增殖试验结果分别见图 2-A、B。Con A质量浓度为2.5 μg·mL^-1时对2种小鼠脾淋巴细胞增殖均出现明显刺激作用，增殖率与细胞阴性对照相比均有统计学非常显著差异（P < 0.01），但C57小鼠脾淋巴细胞增殖率为962%，BALB/c小鼠为425%，增殖程度有差异。牛跟腱匀浆液对2种小鼠脾淋巴细胞增殖均显示出刺激作用，并显示出量效关系。牛跟腱匀浆5倍稀释液使C57小鼠脾淋巴细胞增殖率达179%，而BALB/c小鼠脾淋巴细胞增殖率为143%。试验中牛跟腱匀浆液对C57小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激作用在稀释25倍时变为不明显，但对BALB/c小鼠脾淋巴细胞在稀释50倍时仍有刺激增殖作用，与细胞阴性对照相比有统计学显著差异（P < 0.05），在稀释100倍时才未显示出刺激淋巴细胞增殖。不同稀释度的胶原海绵匀浆液对2种小鼠脾淋巴细胞增殖均未显示出刺激作用，增殖率与细胞阴性对照相比均无统计学显著差异（P > 0.05）。

PC. ConA阳性对照组（Con A positive control group）NC.细胞阴性对照组（negative control group） T1、T5、T25、T50、T100.未稀释，5、25、50、100倍稀释牛跟腱匀浆液（tendon homogenate with undilution，5，25，50 and 100 times dilution） C1、C5、C25、C50.未稀释，5、25、50倍稀释胶原海绵匀浆液（collagen sponge homogenate with undilution，5，25 and 50 times dilution）*P < 0.05；**P < 0.01 图 2 C57（A）和BALB/c（B）小鼠的脾淋巴细胞增殖试验 Fig.2 Experimental results of in vitro lymphocyte proliferation of C57(A) and BALB/c(B) mice

如图 3所示，在试验中，野生型和Gal抗原缺失C57小鼠脾淋巴细胞对Con A和牛心包匀浆液的反应基本一致，在2.5 μg·mL^-1的Con A刺激下增殖率分别为1 344%和1 241%，对牛心包匀浆原液的增殖率分别为172%和195%，与对照组相比具有非常显著统计差异（P < 0.01）。在5倍稀释的牛心包匀浆液刺激下，Gal抗原缺失小鼠脾淋巴细胞增殖率为143%，与对照组相比具有统计学显著差异（P < 0.05），而野生型C57小鼠淋巴细胞增殖率为118%，与对照组相比无统计学显著差异（P > 0.05）。

PC. Con A阳性对照组（Con A positive control group）NC.细胞阴性对照组（negative control group） H1、H5、H25.未稀释，5、25倍稀释牛心包匀浆液（bovine pericardium homogenate with undilution，5 and 25 times dilution）*P < 0.05；**P < 0.01 图 3 野生型C57（A）和Gal抗原缺失小鼠淋巴细胞增殖试验结果 Fig.3 Experimental results of in vitro lymphocyte proliferation of wild-type(A) and Gal antigen deficient C57 (B)mice

从表 1可见，野生型C57和Gal抗原缺失小鼠牛心包匀浆液原液组的活化B细胞百分比与各自对照组相比均增加，有统计学显著性差异（P < 0.01和P < 0.05）。Gal抗原缺失小鼠牛心包匀浆液组除活化B细胞百分比外，其他淋巴细胞亚型百分比与对照组相比均无统计学差异。与对照组相比野生型C57小鼠牛心包匀浆液组的活化T细胞、活化NK细胞、NKT细胞百分比增加，CD4 T细胞百分比减少，均有统计学差异（P < 0.01或P < 0.05），且匀浆原液组这些亚型百分比的变化与匀浆液5倍稀释组相比均显示出量效关系。另野生型C57小鼠仅匀浆液5倍稀释组的CD8 T细胞百分比与对照组相比，有统计学差异，该差异不具有量效关系。

表 1 Tab.1

表 1 淋巴细胞增殖试验流式分型检测（细胞百分比，%） Tab.1 Flow cytometry of lymphocyte proliferation test(cell rate, %) 淋巴细胞亚型 （lymphocyte subtype） 野生型C57小鼠 （wild-type C57 mice） Gal抗原缺失小鼠 （Gal antigen-deficient mice） 对照组 （control group） 匀浆液组 （homogenate group） 匀浆液5倍稀释组 （5 times dilution of homogenate） 对照组 （control group） 匀浆液组 （homogenate group） 匀浆液5倍稀释组 （5 times dilution of homogenate） T细胞（T cell）（CD3+CD19-） 32.72±0.79 30.90±0.32 31.84±0.02 31.00±0.35 31.19±0.59 31.06±0.70 活化T细胞（activated T cell）（CD3+CD69+） 1.40±0.33 2.76±0.31** 1.69±0.37 1.35±0.25 1.61±0.23 1.35±0.17 B细胞B cell（CD3-CD19+） 55.15±0.50 54.52±0.70 56.71±0.99 57.87±0.87 57.82±0.49 57.93±0.69 活化B细胞（activated B cell）（CD19+CD69+） 1.64±0.31 3.82±0.27** 1.92±0.33 1.47±0.29 2.33±0.29* 1.47±0.20 CD4 T细胞（CD4 T cell）（CD3+CD4+） 17.29±0.90 14.85±0.47* 15.34±1.01* 17.42±0.71 16.77±0.59 17.96±0.15 CD8 T细胞（CD8 T cell）（CD3+CD8+） 14.49±0.34 13.99±0.36 13.29±0.56* 12.07±0.20 12.61±1.15 11.69±0.84 NK细胞（NK cell）（CD3-CD49b+） 2.28±0.37 2.93±0.38 2.55±0.12 1.99±0.29 1.90±0.24 2.02±0.14 活化NK细胞（activated NK cell）（CD49b+CD69+） 0.33±0.03 0.68±0.11** 0.24±0.06 0.28±0.09 0.27±0.09 0.21±0.04 NKT细胞（NKT cell）（CD3+CD49b+） 0.62±0.09 1.24±0.08** 0.59±0.07 0.84±0.17 0.74±0.20 0.69±0.06 注（note）：*.P < 0.05，**P < 0.01

表 1 淋巴细胞增殖试验流式分型检测（细胞百分比，%） Tab.1 Flow cytometry of lymphocyte proliferation test(cell rate, %)

在本研究的脾淋巴细胞体外增殖试验体系中，BALB/c小鼠脾淋巴细胞数量与吸收度之间的线性范围比C57小鼠的要窄，这可能与BALB/c小鼠脾淋巴细胞自身对CCK8代谢活性高或者体外活性高有关系。虽然这导致BALB/c小鼠不能准确反映Con A等非特异性有丝分裂原对淋巴细胞增殖的刺激强度，但是对牛跟腱原材料等具有特异性抗原的动物源性生物材料而言，其刺激强度在BALB/c小鼠的线性范围内。另一方面，BALB/c小鼠的线性曲线斜率高于C57小鼠，意味着BALB/c小鼠淋巴细胞数量变化引起的吸收度绝对值的改变将更为明显，这可能是BALB/c小鼠检测出牛跟腱匀浆液稀释50倍时对脾淋巴细胞仍有刺激增殖作用的原因。

与BALB/c小鼠相比，C57小鼠脾淋巴细胞数量与吸收度之间的线性范围更宽，更准确地反映了Con A的刺激强度，同时检测结果反映出了对不同稀释度牛跟腱原材料匀浆液刺激淋巴细胞增殖量效关系的检测能力。5倍稀释的牛跟腱匀浆液刺激C57小鼠淋巴细胞增殖达到179%，而BALB/c小鼠是143%，与对照组相比均具有非常显著差异（P < 0.01），可以认为两者对淋巴细胞增殖试验中，作为阳性对照的含特异性抗原的动物原材料都能表现出阳性反应，均满足体外淋巴细胞增殖试验体系成立的要求。而且，对由牛跟腱提取的胶原蛋白制备的胶原海绵匀浆液，C57小鼠和BALB/c小鼠的脾淋巴细胞均未出现刺激性增殖，表现出一致的特异性，得出了一致结论，通过提纯工艺从牛跟腱获得的胶原海绵免疫原性风险大为降低，在体外不刺激淋巴细胞增殖。以上结果表明，C57小鼠与BALB/c小鼠来源的脾淋巴细胞，都可以应用在本研究规定的体外淋巴细胞增殖试验中。

C57小鼠由于遗传背景清晰，因此常用于各种基因操作以建立模式小鼠。本课题组建立了GGTA1基因敲除的Gal抗原缺失模式小鼠，用于动物源性生物材料的免疫原性评价。在本研究中，Gal抗原缺失的C57小鼠与野生型C57相比，在体外淋巴细胞增殖试验中，对Con A、牛心包匀浆液均表现出阳性淋巴细胞促增殖反应和相似的反应强度，对25倍稀释的牛心包匀浆液都表现出无淋巴细胞的刺激增殖，说明Gal抗原缺失小鼠可以用于建立符合要求的体外淋巴细胞增殖试验体系，且该试验体系反应性与野生型C57小鼠的具有可比性。另一方面，虽然淋巴细胞增殖率相似，但深入分析牛心包匀浆液引起的淋巴细胞增殖中的亚型变化发现，Gal抗原缺失小鼠主要是活化B淋巴细胞百分比增加，而野生型C57除活化B淋巴细胞外，还出现活化T淋巴细胞、活化NK细胞、NKT细胞百分比增加，CD4 T细胞百分比减少，这些差异值得关注，需要进行更多的试验以确认原因并进一步分析这些指标变化产生的影响。Gal抗原缺失小鼠虽然被用于含Gal抗原动物源生物材料的免疫毒理学试验研究，评价残留免疫原性风险。但在脾脏淋巴细胞增殖试验体系中似乎对评价含Gal抗原的动物源性材料的细胞免疫并未显示出优势，这一结果可解释为Gal抗原主要参与体液免疫，而不是细胞免疫。

综上所述，在体外淋巴细胞增殖试验的比较研究中，通过设置Con A非特异性阳性对照组、不同稀释度的动物原材料匀浆液组、脱细胞动物源性生物材料组等，从Con A的强阳性刺激反应，不同稀释度动物原材料匀浆液组反映的量效关系和灵敏性，脱细胞动物源性生物材料阴性反应的特异性等方面衡量，发现C57小鼠与BALB/c小鼠、Gal抗原缺失小鼠与野生型C57小鼠相比，都可以用于建立符合要求的体外淋巴细胞增殖试验体系。