动物源性生物材料在组织修复与重建及组织工程研究中得到了广泛应用，动物源性生物材料来源广泛，包括动物心包、心脏瓣膜、皮肤、骨、小肠粘膜等，主要由细胞外基质组成的特性使其在组织修复重建方面具有独特优势。然而，作为异种生物来源的外科植入物，该类材料在宿主内引起的免疫反应也成为其生物相容性和组织修复重建功能评价中不可缺少的关键内容^[1-3]。

淋巴细胞增殖试验，也被称为T淋巴细胞转化试验，作为一种可反映免疫细胞功能的试验方法已应用于研究药物过敏^[4]、金属植入材料释放的金属离子导致的迟发型超敏反应^[5]等方面，作为体外试验方法用于过敏机理研究或过敏风险评估。医疗器械行业标准YY/T 0606.15-2014推荐淋巴细胞增殖试验作为评价组织工程医疗产品基质或支架细胞免疫反应的一种方法^[6]，该标准规定了试验设计的基本原则，指出合适的淋巴细胞数量、培养时间、受试物浓度等因素应通过试验确定。初期的淋巴细胞增殖试验用³H-胸腺嘧啶核苷检测细胞增殖，但由于放射性同位素的使用受限，现在已有多种非放射性试剂用于淋巴细胞增殖检测，例如5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）^[7]、阿尔玛蓝（Alamar Blue）^[8]、噻唑蓝（MTT）^[9]、CCK8试剂盒（Cell Counting kits-8）^[10]等。在这些淋巴细胞增殖试验中，一般使用刀豆蛋白A（Con A）或植物凝集素（PHA）等有丝分裂原作为阳性对照，通过阳性对照确定试验条件。然而，有丝分裂原对淋巴细胞产生的是非特异性刺激，虽然确定的试验条件能使非特异性阳性对照反应符合要求，但是否能反映动物源性生物材料可能具有的由异种抗原产生的特异性淋巴细胞刺激作用尚有待研究。因此，本试验采用小鼠脾淋巴细胞，使用CCK8检测细胞增殖，通过淋巴细胞数量、Con A浓度、培养时间等优化试验条件后，对不同样品前处理方式制备的动物原材料进行淋巴细胞增殖试验，考察样品前处理对试验结果的影响，为将Con A和动物原材料共同作为动物源性生物材料淋巴细胞增殖试验中的阳性对照提供依据，完善试验体系。

6~8周龄SPF级C57BL/6小鼠由中国食品药品检定研究院实验动物资源所提供。牛心包原材料由广东冠昊生物科技股份有限公司提供。胎牛血清、RPMI-1640细胞培养液（Gibco公司），青链霉素混合液、CCK8试剂盒（北京索莱宝公司），刀豆蛋白A（北京欣经科公司），红细胞裂解液（科瑞达公司），70 μm细胞筛网（SPL公司），96孔细胞培养板（Costar公司）。Spectramax M5酶标仪（MD公司），FACSCanto II流式细胞分析仪（BD公司），JXFSTPRP-CL冷冻研磨仪（上海净信公司），BB150二氧化碳培养箱（Thermo公司），T-60R振荡培养箱（旻全公司），CKX41倒置显微镜（Olympus公司），3K-15离心机（Sigma公司）。

小鼠经5%水合氯醛腹腔注射30 μL:10 g麻醉后，脱颈处死小鼠，浸泡于75%乙醇溶液消毒，在超净台内无菌取脾，将脾剪碎后转移至滤网，用注射器活塞末端研磨脾组织，用培养液冲洗，过滤收集滤液并离心（1 000 r·min^-1）5 min。离心后弃去上清液，加入红细胞裂解液3 mL裂解。再次离心并弃去上清液，加入培养液洗涤后重悬细胞，离心后制备成单细胞悬液，计数后使用。

将96孔板每孔接种的淋巴细胞数量设置为倍比稀释，从每孔8×10⁶个开始倍比稀释至每孔3.12×10⁴个，共9个数量梯度，每孔200 μL细胞培养液，加入20 μL CCK8后在37℃、5%CO₂条件下孵育4 h，直接在酶标仪上检测450 nm波长的吸收度。

研究淋巴细胞接种数量、Con A浓度、培养时间3种因素对淋巴细胞增殖试验的影响。分离获得小鼠脾淋巴细胞后，设定96孔板每孔接种淋巴细胞数量分别为4×10⁵、6×10⁵、8×10⁵个，Con A质量浓度设定为0、2.5、5 μg·mL^-1，分别培养3、4、5 d，每一研究因素的每一试验水平设置6个复孔，在450 mm处检测淋巴细胞加入CCK8后的吸收度，计算各条件下脾淋巴细胞增殖率，考察不同水平的上述因素对淋巴细胞增殖的影响。

取新鲜牛心包组织（原材料），分别进行浸提和匀浆处理，以获得进行体外淋巴细胞增殖试验的供试液。将牛心包材料剪切为1~2 mm的细条状物，采用6 cm²·mL^-1的比例用无血清培养液，在37℃下振摇，浸提72 h，取浸提液添加10%血清后用于试验。将牛心包材料剪切为1~2 mm的细颗粒状物，在匀浆管中加入相同比例的无血清培养液，在冷冻研磨仪中匀浆（4℃，65 Hz，4 min），匀浆液离心（8 000 r·min^-1）6 min后取上清液加入10%血清后用于试验。

分离获得小鼠脾淋巴细胞后，调整细胞悬液浓度为6×10⁶个·mL^-1，除背景空白孔加入培养液100 μL外，其余每孔接种细胞悬液100 μL。试验设置阳性对照组、浸提液细胞对照组、牛心包浸提液组、匀浆液细胞对照组、牛心包匀浆液组。其中，阳性对照组每孔加入Con A溶液100 μL（终浓度2.5 μg·mL^-1）；牛心包浸提液组包含原液组及5倍稀释组，原液组即为加入10%胎牛血清的牛心包浸提液，同时用经37 ℃振摇72 h后的1640培养液配制完全培养液作为浸提液细胞对照组，并用其稀释牛心包浸提原液为5倍稀释组。以上各组每孔加液体积均为100 μL；牛心包匀浆液组也包含原液组及5倍稀释组，用经过匀浆处理的1640配制含10%胎牛血清的完全培养液，作为匀浆液细胞对照组，并用其5倍稀释匀浆原液。以上各组每孔加液体积均为100 μL。按以上方案接种2块96孔板，加样结束后，将96孔板放入细胞培养箱，37 ℃、5% CO₂培养72 h。在淋巴细胞培养68 h后，取其中1块96孔板每孔加入20 μL的CCK8试剂，继续培养4 h后结束培养，使用酶标仪在450 nm处检测吸收度。另1块96孔板培养72 h后进行淋巴细胞流式分型检测。

在体外淋巴细胞增殖试验培养结束后，将96孔板每孔细胞吹打混匀，吸出淋巴细胞悬液至微量离心管，离心（1 000 r·min^-1）5 min后去除上清液，加入1% BSA-PBS 0.5 mL重新悬浮成单细胞悬液。取3份各单细胞悬液100 μL，分别加入10 μL不同CD组合抗体，用于T淋巴细胞分型的CD45、CD3、CD4、CD8抗体，用于B淋巴细胞分型的CD45、CD3、CD19、CD69抗体，用于自然杀伤细胞（natural killer，NK）和自然杀伤T细胞（natural killer T cell，NKT）分型的CD45、CD3、CD49_b、CD69抗体。室温避光孵育20 min后，用1% BSA-PBS 2 mL离心洗涤2次，加入1% BSA-PBS 0.5 mL制备成单细胞悬液，在流式细胞仪上检测，使用FACS DIVA SOFTWARE软件分析检测结果。

试验结果用平均值±标准差表示，采用SPSS 21.0对正态分布、方差齐性的多组间数据进行单因素方差分析，选择与对照组比较的Dunnett法进行两两比较，P < 0.05时认为差异具有统计学显著性意义。

在淋巴细胞增殖试验中，当96孔板每孔淋巴细胞数量在62 500~2 000 000个时，加入CCK8后孵育产物的吸收度A_{450 nm}与细胞数量成线性关系（R²=0.99），见图 1。而在淋巴细胞数量过低或过高时，CCK8生成产物的A_{450 nm}将不能准确反映淋巴细胞数量的变化。

图 1 CCK8检测淋巴细胞数量的线性范围 Fig.1 Linear range for lymphocyte quantity detected by CCK8

淋巴细胞培养时间、接种数量、Con A浓度3种因素对淋巴细胞增殖试验的影响见表 1。与未加入Con A的细胞对照孔相比，加入Con A的阳性对照孔一般在培养3 d时淋巴细胞增殖率最高，因此体外淋巴细胞增殖试验培养时间选择3 d。当对照孔接种4×10⁵个淋巴细胞时，虽然加入Con A后第3天淋巴细胞增殖约8~11倍，加入5 μg·mL^-1的Con A后第5天淋巴细胞增殖约45倍，但对照孔吸收度平均值在第3天为0.072 4，而第5天仅0.024 9。作为淋巴细胞增殖率的比较基准易产生较大的变异，显示淋巴细胞接种数量宜大于每孔4×10⁵个。而接种6×10⁵个淋巴细胞与8×10⁵个淋巴细胞相比，前者在Con A刺激下3 d的增殖率为888%~964%，高于后者的242%~444%，由此体外淋巴细胞增殖试验每孔淋巴细胞接种数量确定为6×10⁵个。在Con A浓度分别为2.5、5 μg·mL^-1时，接种6×10⁵个淋巴细胞培养3 d的增殖率相近，分别为964%和888%，表明都是适宜的阳性对照Con A浓度。因此，本试验中小鼠脾淋巴细胞体外增殖试验条件确定为每孔接种6×10⁵个淋巴细胞，阳性对照孔Con A质量浓度为2.5 μg·mL^-1，培养时间为3 d。

表 1 Tab.1

表 1 不同研究因素及其水平下淋巴细胞体外增殖试验结果（平均值±标准差） Tab.1 Experimental results of lymphocyte proliferation in vitro under different research factors and their levels(mean±SD) 细胞数 （cell number） 培养时间 （culture time）/d Con A 0 μg·mL-1 Con A 2.5 μg·mL-1 Con A 5 μg·mL-1 A450 nm A450 nm 增殖百分率 proliferation percentage/% A450 nm 增殖百分率 proliferation percentage/% 8×105 3 0.486 2±0.077 5 2.161 1±0.224 4 444±46 1.665 1±0.264 9 242±54 4 1.126 0±0.143 8 0.810 0±0.059 3 72±5 1.028 9±0.048 1 91±4 5 0.881 9±0.144 7 0.888 5±0.138 6 101±16 0.895 9±0.084 3 102±10 6×105 3 0.242 2±0.051 7 2.333 4±0.118 0 964±49 2.149 6±0.088 9 888±37 4 0.858 5±0.081 0 0.875 1±0.138 9 102±16 0.916 3±0.050 3 107±6 5 0.173 1±0.034 5 0.857 1±0.111 5 495±64 0.508 9±0.130 5 294±75 4×105 3 0.072 4±0.009 9 0.604 1±0.185 9 834±257 0.817 5±0.198 4 1 129±274 4 0.297 1±0.119 1 0.892 6±0.113 8 300±38 0.932 0±0.063 2 314±21 5 0.024 9±0.003 3 0.062 1±0.003 7 249±15 1.139 9±0.332 7 4 575±1 335

表 1 不同研究因素及其水平下淋巴细胞体外增殖试验结果（平均值±标准差） Tab.1 Experimental results of lymphocyte proliferation in vitro under different research factors and their levels(mean±SD)

试验中2.5 μg·mL^-1的Con A阳性对照组相对增殖率是882%，符合预期。牛心包原材料的浸提液和匀浆上清液均促进了淋巴细胞增殖，结果见图 2。其中牛心包浸提液原液和5倍稀释液的淋巴细胞增殖率分别为228%和191%，与对照组相比均有非常显著的统计学差异（P < 0.01），显示牛心包浸提液中存在能刺激淋巴细胞增殖的特异性抗原，即使5倍稀释后，特异性抗原的刺激作用无明显变化。牛心包匀浆液原液和5倍稀释液的淋巴细胞增殖率分别为186%和200%，与对照组相比均有非常显著的统计学差异（P < 0.01），表明牛心包匀浆液中也存在能刺激淋巴细胞增殖的特异性抗原。以上结果表明，本研究建立的小鼠脾体外淋巴细胞增殖试验方法，不仅能反映出Con A等非特异性有丝分裂原对淋巴细胞的增殖作用，还能检测出异种动物源性生物材料来源的特异性抗原对淋巴细胞增殖的刺激作用。

图 2 牛心包浸提液和匀浆液体外淋巴细胞增殖试验结果 Fig.2 Results of lymphocyte proliferation test where the bovine pericardium extract and homogenate liquid were designed as positive groups

在体外淋巴细胞增殖试验中，与细胞培养液对照组相比，加入Con A的阳性对照组检测的所有淋巴细胞亚型百分比均有统计学显著或非常显著的差异（P < 0.05或P < 0.01），详见表 2。其中T细胞、活化T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、活化B细胞、活化NK细胞、活化NKT细胞百分比升高，B细胞、NK细胞百分比降低，这符合Con A作为刺激T细胞增殖的有丝分裂原的作用。

表 2 Tab.2

表 2 淋巴细胞增殖的流式分型检测 Tab.2 Flow cytometry of lymphocyte proliferation 淋巴细胞亚型 （lymphocyte subtype） 对照组 （control group） 浸提液 （extract group） 5倍稀释浸提液 （5 times dilution of extract） 匀浆液 （homogenate group） 5倍稀释匀浆液 （5 times dilution of homogenate） Con A T细胞（T cell）（CD3+CD19-） 32.72±0.79 29.93±0.76* 32.23±0.78 30.90±0.32 31.84±0.02 53.32±1.80** 活化T细胞（activated T cell）（CD3+CD69+） 1.40±0.33 2.44±0.20** 1.97±0.21 2.76±0.31* 1.69±0.37 26.88±0.87** B细胞（B cell）（CD3-CD19+） 55.15±0.50 57.37±0.82* 56.97±0.64* 54.52±0.70 56.71±0.99 23.79±1.15** 活化B细胞（activated B cell）（CD19+CD69+） 1.64±0.31 3.51±0.11** 2.29±0.34 3.82±0.27** 1.92±0.33 16.91±1.24** CD4 T细胞（CD4 T cell）（CD3+CD4+） 17.29±0.90 14.98±0.06* 15.77±0.48* 14.85±0.47* 15.34±1.01 26.26±0.33** CD8 T细胞（CD8 T cell）（CD3+CD8+） 14.49±0.34 13.91±0.59 13.86±0.93 13.99±0.36 13.29±0.56* 44.82±0.35** NK细胞（NK cell）（CD3-CD49b+） 2.28±0.37 43.00±0.78** 23.89±0.76** 2.93±0.38 2.55±0.12 1.17±0.01* 活化NK细胞（activated NK cell）（CD49b+CD69+） 0.33±0.03 3.38±0.09** 1.74±0.06** 0.68±0.11** 0.24±0.06 4.75±0.33** NKT细胞（NKT cell）（CD3+CD49b+） 0.62±0.09 6.01±0.17** 3.50±0.20** 1.24±0.08** 0.59±0.07 6.92±0.53** 注（note）：*P < 0.05，**P < 0.01

表 2 淋巴细胞增殖的流式分型检测 Tab.2 Flow cytometry of lymphocyte proliferation

与细胞培养液对照组相比，加入牛心包浸提液的试验组T细胞、CD4 T细胞百分比下降，但活化T细胞、B细胞、活化B细胞百分比升高。上述变化均表现出剂量相关性，即牛心包浸提液原液比5倍稀释液更为明显，与对照组相比均有统计学显著性差异（P < 0.05或P < 0.01），详见表 2。与细胞培养液对照组相比，加入牛心包浸提液使NK细胞、活化NK细胞、NKT细胞百分比明显升高，牛心包浸提液原液比5倍稀释液更为明显，且两者与对照组相比统计学均有非常显著差异（P < 0.01），详见表 2。以上结果表明在小鼠体外脾淋巴细胞增殖试验中，牛心包浸提液主要引起NK细胞、NKT细胞、B细胞、活化NK细胞、活化B细胞、活化T细胞百分比升高。

与细胞培养液对照组相比，加入牛心包匀浆液的试验组活化T细胞、活化B细胞、活化NK细胞、NKT细胞百分比升高，CD4 T细胞、CD8 T细胞百分比降低。除CD8 T细胞百分比降低，在5倍稀释匀浆液组比原液组更明显外，其余指标的变化均是牛心包匀浆液原液比5倍稀释液更为明显，表现出剂量相关性，与对照组相比均有统计学显著性差异（P < 0.05或P < 0.01），而5倍稀释液组的这些指标与对照组相比虽有升高或降低，但无统计学显著性差异，详见表 2。以上结果表明在小鼠体外脾淋巴细胞增殖试验中，牛心包匀浆液主要引起NKT细胞、活化NK细胞、活化B细胞、活化T细胞百分比升高。

牛心包浸提液与匀浆液相比，两者在小鼠体外脾淋巴细胞增殖试验中引起了一些相似的变化，如NKT细胞、活化NK细胞、活化B细胞、活化T细胞百分比升高等。不同的是牛心包浸提液组NK细胞百分比43.00%，5倍稀释浸提液组NK细胞百分比23.89%，与对照组NK细胞百分比2.28%相比明显倍增，而牛心包匀浆液组NK细胞百分比2.93%，5倍稀释匀浆液组NK细胞百分比2.55%，与对照组相比无明显差异，详见表 2及图 3示例。虽然2组活化NK细胞、NKT细胞与对照组相比均有统计学非常显著差异（P < 0.01），但牛心包浸提液组该2项指标升高幅度数倍高于牛心包匀浆液组，详见表 2。

A.细胞对照组（cell control）B.Con A阳性对照（Con A positive control）C.牛心包浸提液（bovine pericardial extract）D.5倍稀释浸提液（5 times dilution of extract）E.牛心包匀浆液（bovine pericardial homogenate）F.5倍稀释匀 图 3 淋巴细胞增殖试验NK细胞（CD3-CD49b+）和NKT细胞（CD3+CD49b+）的流式结果示例 Fig.3 Typical results of flow cytometry of NK cells (CD3-CD49b+) and NKT cells (CD3+CD49b+)

体外淋巴细胞增殖试验受众多因素影响，如淋巴细胞来源的动物种属等。有研究发现在相同条件下，BALB/c或昆明种小鼠脾脏、SD大鼠脾脏和人外周血淋巴细胞增殖试验的适宜细胞浓度不同^[11]；不同种属来源的淋巴细胞对Con A等有丝分裂原的增殖反应存在种属差异，并且同一种属动物，如近交系小鼠淋巴细胞增殖的RSD小于远交系小鼠^[12]。淋巴细胞增殖的检测方法也影响其他试验条件的选择。有研究发现，用MTT法检测脾淋巴细胞增殖，合适的脾细胞数量为每孔1×10⁵~1.5×10⁵个^[12-13]，而在CCK8检测法中，合适的脾淋巴细胞数量为每孔5×10⁵个^[14]，但对于相同细胞数量的培养体系，CCK8法灵敏度要高于MTT法^[15]。研究还发现实验室操作也会影响淋巴细胞增殖试验，例如分离脾淋巴细胞时，以轻压方式制备的脾细胞增殖率高于轻磨方式^[14]。因此，每个实验室在开展体外淋巴细胞增殖试验时，都应验证或研究需要确认的多种试验条件参数。本研究采用C57BL/6小鼠脾淋巴细胞，使用CCK8检测细胞增殖，通过优化淋巴细胞数量、Con A浓度、培养时间等试验条件后，确认每孔接种6×10⁵个淋巴细胞，阳性对照Con A质量浓度为2.5 μg·mL^-1，培养时间3 d为本实验室开展体外淋巴细胞增殖试验的适宜条件。

淋巴细胞增殖试验一般选择Con A或PHA为阳性对照，这些都是非特异性的有丝分裂原。虽然确定的试验条件能使非特异性阳性对照反应符合要求，但试验是否能检测出动物源性生物材料异种抗原产生的特异性淋巴细胞刺激作用尚有待证实。另一方面，从组织来源看，动物源性生物材料种类很多，虽然都是细胞外基质，但可能含有的抗原性成分组成差异很大，目前尚无法确定一种通用的抗原特异性阳性对照。因此，从策略上可以选择每种动物源性生物材料的原材料作为其淋巴细胞增殖试验中的特异性抗原阳性对照。例如牛心包用于制备硬脑膜生物补片，脱细胞处理是产品生产过程中降低或消除免疫原性的重要环节，牛心包中的细胞、Gal抗原、DNA等免疫原性物质经脱细胞工艺去除，但在得到的硬脑膜生物补片中这些成分的残留是否会影响淋巴细胞增殖是必要的免疫学评价要求。因此，用含有细胞、Gal抗原、DNA等成分的原材料牛心包作为淋巴细胞增殖试验的阳性对照，以此确认试验体系的反应灵敏性，与Con A或PHA等非特异性的有丝分裂原相比是更为合理的选择。

浸提是制备医疗器械产品供试液的常用方法，而动物源性生物材料在发挥修复重建作用时一般可降解，从而释放难以浸提出来的抗原成分。基于此，动物源性生物材料免疫学评价试验中除考虑浸提可沥滤物之外，还要考虑材料自身及其难以浸提出来的抗原成分的影响。在体外试验中可以通过匀浆等样品前处理方式，制备含有原材料中所有抗原成分的供试液，实现抗原成分的充分暴露。本研究分别制备了牛心包浸提液和匀浆液进行淋巴细胞增殖试验，发现两者导致的淋巴细胞增殖率均为细胞对照组的2倍左右，表明本研究采用的淋巴细胞增殖试验条件可以检测出牛心包中抗原的特异性淋巴细胞刺激作用，浸提和匀浆2种不同的处理方式都可暴露牛心包抗原。进一步分析发现虽然两者引起的淋巴细胞增殖率差别不明显，但牛心包浸提液与匀浆液在NK细胞百分比、活化NK细胞百分比、NKT细胞百分比上有明显差异，表明2种不同的处理方式可能暴露的牛心包抗原有所不同，导致了淋巴细胞增殖试验中淋巴细胞亚型百分比差异。进一步的浸提液和匀浆液分析，例如对蛋白类抗原的定性和定量分析将有助于了解和解释这些差异。这也提示在建立动物源性生物材料的淋巴细胞增殖试验时，在确认供试液制备方式时宜考虑浸提和匀浆的不同处理方式，以获取与动物源性生物材料相关的细胞免疫方面的更多信息。

综上所述，本研究建立了以动物组织（原材料）为抗原特异性阳性对照的体外淋巴细胞增殖试验，浸提和匀浆处理方式均可以产生淋巴细胞增殖阳性结果，完善了仅用Con A或PHA等有丝分裂原作为阳性对照的淋巴细胞增殖试验体系。