牛黄清胃丸收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》第一册，由牛黄、大黄、菊花、麦冬、薄荷、石膏、栀子、玄参、番泻叶、黄芩、甘草等17味中药组成，具有清胃泻火及润燥通便的功效，用于心胃火盛，头晕目眩，口舌生疮，牙龈肿痛，乳蛾咽痛，便秘尿赤^[1]。中成药基质复杂，指标成分含量较低，采用传统的薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）等方法对其进行分析，需要烦琐的提取、净化步骤，并对色谱的分离能力有较高的要求，所建方法往往耗时、费力。与传统的湿化学分析方法不同，近红外光谱（NIRS）可以反映样品化学特征全貌，结合模式识别技术可以对研究对象进行鉴别或分类^[2-8]，运用多变量校正方法还可实现多个指标成分的同时测定^[9-15]，具有快速、简便、无损的优势。

为全面评价牛黄清胃丸质量，提高检验效率，本文采用近红外光谱技术结合不同化学计量学算法，建立了该制剂的定性定量分析模型，提出了中成药中辅料蜂蜜的近红外光谱质量评价方法，为中药的快速、无损分析提供了新的思路。

1 仪器与试药

Thermo公司Antaris近红外光谱仪，配有积分球附件、Result操作软件与TQ Analyst分析软件。

18个厂家生产的49批次牛黄清胃丸样品均为2018年国家药品监督抽验样品，模拟伪品牛黄清心丸（局方）、牛黄镇惊丸、上清丸购于药店；各样品及模拟伪品均为大蜜丸。

2 方法与结果 2.1 光谱采集

取大蜜丸1丸，直接置于近红外光谱仪积分球附件测量窗口，采集近红外漫反射光谱。以仪器内置背景为参比，扫描范围4 000~10 000 cm^-1，扫描次数64次，分辨率8 cm^-1。光谱数据取3次采样的平均值。49批次样品光谱见图 1。

2.2 参比值测定

甲苯法^[16]测定水分。HPLC-ELSD法测定果糖、葡萄糖、麦芽糖含量^[17]；色谱条件：采用ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm），柱温35 ℃，流动相为乙腈（含0.2%三乙胺）-水（75：25），流速0.2 mL·min^-1，漂移管温度55 ℃，氮气压力276 kPa，增益100，数据率2 pps，冷却模式。

2.3 真伪鉴别

采用相似度匹配（similarity match，SM）算法进行真伪鉴别，通过比较未知样品与校正集样品的标准光谱在某个或多个波段的光谱信息，得到样品匹配程度。对标准光谱进行Gram-Schmidt分析，得到的正交模型代表了所有标准光谱中全部数据点提供的光谱信息。在对样品进行分析时，使用Gram-Schmidt模型将样品光谱中该模型包含的所有光谱信息去除得到样品的残差光谱。最后，将样品光谱同其残差光谱相比较得到相似度。相似度的范围为0~100，其值越高，说明未知样品与校正集样品的标准样品的光谱越相似。随机选取40批抽验样品组成标准光谱库，建立相似度匹配模型；剩余9个厂家各1批共9批抽验样品组成验证集；由于缺乏市售伪品，故购买与牛黄清胃丸处方、工艺相近的3种原粉投料的大蜜丸，牛黄清心丸（局方）（含牛黄、当归、川芎、甘草、山药、黄芩、炒苦杏仁、大豆黄卷、大枣、炒白术、茯苓、桔梗、防风、柴胡、阿胶、干姜、白芍、人参、六神曲（炒）、肉桂、麦冬、白蔹、蒲黄（炒）、人工麝香、冰片、水牛角浓缩粉、羚羊角、朱砂、雄黄），牛黄镇惊丸（含牛黄、全蝎、炒僵蚕、珍珠、人工麝香、朱砂、雄黄、天麻、钩藤、防风、琥珀、胆南星、制白附子、半夏（制）、天竺黄、冰片、薄荷、甘草），上清丸（含大黄（酒炒）、黄芩（酒炒）、连翘、菊花、白芷、黄柏（酒炒）、栀子、荆芥、防风、薄荷、川芎、桔梗）各1批，作为模拟伪品。将上述样品光谱代入建立的模型，计算相似度，考察模型准确性。

为减小实验过程中样品颗粒尺寸、均匀性等因素对近红外光谱的影响，采用多重散射校正技术（multiplicative scatter correction，MSC）对原始近红外光谱进行处理。光谱基线的漂移则通过微分处理加以校正。一阶微分处理可以消除常数背景，二阶微分可以消除线性背景。在对光谱数据作微分处理时，由于噪声信号也被放大，因此通常在微分之前需要对光谱数据作平滑处理，常用的包括Norris平滑和S-G平滑。图 2、3分别为依次经MSC、Norris导数平滑滤波和一、二阶微分处理后得到的光谱图，从中可以看出，近红外光谱在经MSC和微分处理后，不仅可以较好地消除基线偏移，还可以更为细致地反映样品的光谱特征。

以模型对真“伪”样品的区分能力为指标优化建模参数，最终选择4 000~10 000 cm^-1光谱范围，对二阶光谱加以MSC校正和S-G平滑处理，采用相似度匹配法建立模型牛黄清胃丸标准光谱库。结果验证集9批次牛黄清胃丸的相似度在92.42~98.03之间，剂型相同处方不完全相同的3批次大蜜丸的相似度在51.21~75.34之间。设定阈值为90，相似度匹配模型可区分正品与模拟伪品，准确率为100%。

2.4 含量测定

偏最小二乘法（partial least square，PLS）是近红外光谱分析中使用最多、效果较好的一种多变量校正方法，通过对变量系统中信息中心进行综合筛选，从中选取若干个对系统具有最佳解释能力的新综合变量进行回归建模。在PLS建模过程中，谱区范围、预处理方法和主因子数的选择是决定所构建的近红外模型质量高低的关键因素。选择恰当的建模参数不仅有利于加快模型的运算速度，而且会提高模型的精度和预测能力。

以相关系数（correlation coefficient，r）和交叉验证均方差（root mean square error of cross validation，RMSECV）为评价指标，比较了不同波数范围、光谱预处理方法、主因子数对模型的影响，初步确立了近红外多元校正模型的建模参数（见表 1）。优化了建模参数后，按含量从小到大的顺序，每个模型随机选取9批抽验样品组成验证集，其余组成校正集。以校正集样品光谱和化学参考值为基础，采用偏最小二乘算法分别建立牛黄清胃丸中水分、果糖、葡萄糖、麦芽糖的近红外定量分析模型。为了检验以上建立的近红外模型的预测精度，对验证集样品相应化学成分进行了预测，结果显示预测值与实测值之间有较好的相关性。各模型的预测范围、相关系数（r）、校正均方差（root mean square error of calibration，RMSEC）、预测均方差（root mean square error of prediction，RMSEP）等评价指标见表 2。

3 结论

采用近红外光谱技术结合化学计量学算法建立了牛黄清胃丸的真伪鉴别和多指标含量测定模型。同传统的TLC、HPLC等方法相比，近红外光谱法可以节省大量分析时间和费用，显示出良好的实用价值和应用前景。

蜂蜜作为重要辅料在中成药中广泛使用，其优劣直接影响制剂品质。近年来，蜂蜜掺假现象较为严重^[18]，现有标准和文献一般采用HPLC-ELSD法测定样品中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量，以含量和比值评价蜂蜜质量^{[17, 19-20]}。仅有少数学者采用近红外光谱法检查蜂蜜掺伪^[21-22]，中成药中蜂蜜的近红外光谱分析尚未见报道。由于牛黄清胃丸中麦冬、桔梗等药味富含糖分，造成缺蜂蜜的阴性样品中蔗糖含量较高，故本文通过建立样品中果糖、葡萄糖、麦芽糖的近红外光谱含量测定模型，快速、无损评价大蜜丸中蜂蜜质量。《中华人民共和国药典》2015年版一部蜂蜜标准项下规定“果糖与葡萄糖的总量不得少于60%，麦芽糖不得过5%，果糖与葡萄糖含量比值不得小于1.0”。结合蜂蜜在牛黄清胃丸中的比例折算，则本品中果糖与葡萄糖含量之和应大于35%，麦芽糖不得过3%，果糖与葡萄糖含量比值不得小于1.0。结果显示，42批样品符合上述拟定限度的要求，7批样品中果糖与葡萄糖含量比值在0.8~0.9之间，其余项目符合要求，说明本品中蜂蜜投料质量总体较好。

本文还尝试对牛黄清胃丸中其他成分，如黄芩苷、盐酸小檗碱、栀子苷、龙脑等，进行快速近红外光谱分析，但由于样品基质复杂，指标成分含量极低，造成定量模型的预测精度较差，相对预测均方差在10%之上，准确性远远低于HPLC、GC等参比方法。如何从背景干扰中挖掘出与目标化学成分直接相关的光谱信息，提高预测结果的准确性，是今后工作的发展方向之一。