附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品^[1]。在我国传统医学中应用历史悠久，被称为“回阳救逆第一品”。《中华人民共和国药典》2015年版一部中附子以苯甲酰新乌头原碱（C₃₁H₄₃NO₁₀）、苯甲酰乌头原碱（C₃₂H₄₅NO₁₀）和苯甲酰次乌头原碱（C₃₁H₄₃NO₉）这3个单酯型生物碱的总量作为质量控制指标，含量的高低可以反映附子的内在质量。附子不同的性状中，黑顺片为外皮黑褐色、切面暗黄色，白附片为黄白色。那么，这种基于有效成分含量的质量评价与传统的外观色泽之间是否具有相关性，或者说，能否采用色泽的测定进行附子质量的评价，起到更加便捷、快速、经济的效果，是人们关心的问题。

药材的传统质量评价，是历来形成的包括色泽在内的经验评价方法，至今仍发挥着重要的作用。近年来文献证实传统经验评价具有科学性和可重复性^[2-3]。色泽是药材鉴别的重要内容，通过色泽可直观快速地判断药材的优劣。研究表明，色泽的测定数据可以用于药材的质量评价^[4-5]，尤其是5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）的含量被认为与色泽的改变具有直接的相关性^[6-8]。现代色彩分析技术的发展，使色泽的测量和分析更加精密和准确，且可以将人的主观判断客观量化。在传统的色泽评价指标中引入现代的色彩分析技术，对于中药材及饮片的质量评价具有极为重要的意义。

国内外学者在探讨附子药效物质基础方面曾做了大量的基础研究^[9-12]，但同时结合传统性状进行客观分析尚未见报道。本文采用色差仪测定附子色泽，采用HPLC法测定苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱3个单酯型生物碱以及5-HMF含量，对色泽与化学成分之间相关性进行分析，为附子质量的分析、评价与提高奠定了基础。

1 仪器与试药

NH310型高品质便携式电脑色差仪[光源：D65（代表自然日光，6504 K），CIE（国际照明委员会）认可，深圳市三恩驰科技有限公司]；DFT-50A型手提式高速粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；LC-20AT型高效液相色谱仪，SPD-M20A型二极管阵列检测器（岛津公司）；电子分析天平（XS105 DualRange-0.000 01 g，Ohaus CP224C-0.000 1 g）；KQ-100E型超声波清洗器（100 W，昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9063A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；RV10DS77型旋转蒸发仪（Ika仪器设备有限公司）。

对照品苯甲酰新乌头原碱（批号20170112，含量99.59%）、苯甲酰乌头原碱（批号20170110，含量99.76%）、苯甲酰次乌头原碱（批号20170502，含量98.51%）均购自宝鸡市辰光生物科技有限公司；5-HMF对照品（批号WXBC1154V，纯度≥99%）购自美国Sigma-Aldrich公司；乙腈、四氢呋喃、甲醇为色谱纯（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；水为娃哈哈纯净水；冰醋酸为优级纯（国药集团化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯，其中氨试液为取浓氨溶液（国药集团化学试剂有限公司）40 mL，加水使成100 mL，即得；醋酸铵（北京北化精细化学品有限责任公司）。

16份样品来源于全国各大药材市场、药房或专业合作社，经中国中医科学院中药研究所巢志茂研究员鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品，见表 1。

2 方法与结果 2.1 附子粉末的色泽测定

色差仪利用的CIE LAB色度空间为1976年CIE推荐的均匀颜色空间，1987年我国发布GB7921-87，将LAB空间作为国家标准。CIE LAB是利用△L、△a、△b 3个坐标轴，指示颜色在几何空间中的位置^[13-14]。△L表示明度，数值越大越感觉白，越小越感觉黑；△a表示红色到绿色，数值越大越感觉红，越小越感觉绿；△b表示从黄色到蓝色，数值越大越感觉黄，越小越感觉蓝。

首先进行黑白校正，然后以白色A 4打印纸作为标准测定L_标^*、a_标^*、b_标^*，再取附子样品粉末（过3号筛）约3 g置于样品皿中，测定L_样^*、a_样^*、b_样^*，计算△L=L_样^*-L_标^*，△a=a_样^*-a_标^*，△b=b_样^*-b_标^*，△E=（△L²+△a²+△b²）^1/2，结果见表 2。

2.2 3种单酯型生物碱的含量测定 2.2.1 色谱条件

采用Diamonsil Plus C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为乙腈-四氢呋喃（25：15），流动相B为每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL的0.1 mol·L^-1醋酸铵溶液，梯度洗脱（0~48 min，12%A→22%A；48~50 min，22%A→35%A），流速1.0 mL·min^-1，检测波长235 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。对照品和样品色谱图见图 1。

2.2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取苯甲酰新乌头原碱对照品6.56 mg，苯甲酰乌头原碱对照品6.89 mg，苯甲酰次乌头原碱对照品6.21 mg，置50 mL量瓶中，加异丙醇-二氯甲烷（1：1）溶解，并定容至刻度，即得混合对照品储备液；再精密量取2 mL置25 mL量瓶中，加异丙醇-二氯甲烷（1：1）定容至刻度，即得质量浓度分别为10.46、11.00、9.79 μg·mL^-1的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取样品粉末（过3号筛）约2 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，加氨试液3 mL，精密加入异丙醇-乙酸乙酯（1：1）50 mL，称量，超声处理（功率100 W，频率40 kHz，水温20~25 ℃）30 min，放冷，用异丙醇-乙酸乙酯（1：1）补足减失的量，摇匀，滤过；精密量取续滤液20 mL，40 ℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-二氯甲烷（1：1）3 mL溶解，用0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品储备液0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL，分别置5 mL量瓶中，用异丙醇-二氯甲烷（1：1）定容至刻度，按“2.2.1”项下的色谱条件进样，测定其峰面积值。以峰面积（Y）对进样量（X）进行回归处理，得苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱3个生物碱的回归方程：

$ \begin{array}{*{20}{l}} {Y = 962\ 776X - 1\ 271\quad {R^2} = 0.999\ 7}\\ {Y = 993\ 898X - 1\ 793\quad {R^2} = 0.999\ 6}\\ {Y = 909\ 655X - 2\ 184\quad {R^2} = 0.999\ 6} \end{array} $

表明苯甲酰新乌头原碱进样量在0.01~0.84 μg，苯甲酰乌头原碱进样量在0.01~0.88 μg，苯甲酰次乌头原碱进样量在0.01~0.78 μg范围内与峰面积线性关系良好。

2.2.5 精密度试验

精密吸取“2.2.2”项下的混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的峰面积值。计算其RSD（n=6）分别为0.49%、0.46%、1.0%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验

取1号样品粉末，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别在0、3、6、9、12、24 h进样测定，记录苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的峰面积值，计算其RSD（n=6）分别为0.45%、1.0%、0.30%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验

取同一样品（1号样品）粉末6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样测定。记录苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的峰面积值，计算平均含量（n=6）分别为0.016%、0.002%、0.001%，RSD分别为1.4%、1.7%、1.5%，表明本试验方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验

取同一样品（1号样品）粉末6份，每份约1 g，精密称定，分别精密加入“2.2.2”项下的混合对照品溶液2 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件进样测定，结果见表 3。

2.2.9 检测下限及定量下限

将“2.2.2”项下的混合对照品溶液逐级稀释，按“2.2.1”项下的色谱条件测定。按S/N=3，确定苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的检测下限分别为1.57×10^-4、1.65×10^-4、1.47×10^-4 μg；按S/N=10，确定定量下限分别为5.23×10^-4、5.50×10^-4、4.89×10^-4 μg。

2.2.10 样品含量测定

取样品粉末（过3号筛），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件进样测定，以回归方法计算含量，结果见表 4。

2.3 5-HMF的含量测定 2.3.1 色谱条件

采用Agilent C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%甲酸水（7：93），流速1.0 mL·min^-1，柱温30 ℃，检测波长284 nm，进样量10 μL。对照品和样品色谱图见图 2。

2.3.2 对照品溶液的制备

精密称取5-HMF对照品21.44 mg，置10 mL棕色量瓶中，加50%甲醇水溶液溶解，并定容至刻度（为对照品储备液），再精密量取1 mL置10 mL棕色量瓶中，以50%甲醇水溶液定容至刻度，即得质量浓度为212.26 μg·mL^-1的对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备

精密称取样品粉末（过3号筛）约2 g，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇水溶液20 mL，称量，超声处理（功率100 W，频率40 kHz，水温20~25 ℃）30 min，放冷，用50%甲醇水溶液补足减失的量，摇匀，用0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 线性关系考察

精密吸取对照品储备液适量，以50%甲醇水溶液稀释，配制成2.65、5.31、10.61、21.23、42.46、84.9 μg·mL^-1的系列溶液，按“2.3.1”项下的色谱条件进样，测定其峰面积值。以峰面积（Y）对进样量（X）进行回归处理，得回归方程：

$ Y = 5\ 682\ 602X + 18\ 217\quad {R^2} = 0.999\ 8 $

表明5-HMF进样量在0.03~0.85 μg范围内与峰面积线性关系良好。

2.3.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积值。计算其RSD（n=6）为0.12%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验

取9号样品粉末，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别在0、3、6、9、12、24 h进样测定，记录峰面积值。计算其RSD（n=6）为0.67%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.7 重复性试验

取同一样品（9号样品）粉末6份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样测定，记录峰面积值。计算平均含量（n=6）为0.001 80%，RSD为0.98%，表明本试验方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验

取同一样品（9号样品）粉末6份，每份约1 g；另取对照品溶液0.75 mL置10 mL量瓶中，以50%甲醇水溶液定容至刻度，再分别取1 mL加入样品中，按“2.3.3”项下方法制备供试溶液，按“2.3.1”项下的色谱条件进样测定，测定结果见表 5。

2.3.9 检测下限及定量下限

将“2.3.2”项下对照品溶液逐级稀释，按“2.3.1”项下的色谱条件测定，确定检测下限（S/N=3）为2.04×10^-4 μg，定量下限（S/N=10）为6.79×10^-4 μg。

2.3.10 样品含量测定

取本品粉末（过3号筛），按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下的色谱条件测定，结果见表 6。

3 讨论 3.1 色泽测定结果及变化趋势

从表 2可以看出，在D65光源下色度值△L介于-34.38~-14.76，平均值为-23.06；△a介于2.54~5.22，平均值为3.43；△b介于10.94~16.34，平均值为12.81；△E介于20.13~37.05，平均值为26.80。

3.2 色泽测定结果与化学成分相关性分析

应用SPSS分析软件，对表 2的色泽测定结果与表 4、6的化学成分含量测定结果进行相关性分析，结果见表 7。从表 7可以看出，△L与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的含量及3个单酯型生物碱的总含量呈负相关，与5-HMF的含量呈正相关；△a与苯甲酰新乌头原碱及5-HMF的含量呈负相关，与苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱及3个单酯型生物碱的总含量呈正相关；△b与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和5-HMF的含量、3个单酯型生物碱的总含量均呈负相关，与苯甲酰次乌头原碱的含量呈正相关；△E与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的含量呈显著正相关（P < 0.05），与苯甲酰次乌头原碱及3个单酯型生物碱的总含量呈极显著正相关（P < 0.01），与5-HMF的含量呈负相关。

由上述分析可以得出，本试验所采集到的16份附子样品，不论是什么形式的样品，哪里产的，是药材还是炮制品，或者是不同的炮制品，形成的共性的最后结果是，色差值与生物碱含量、色差值与5-HMF含量之间存在一定的相关性，从而说明了色差值对附子样品鉴别的重要意义。

3.3 小结

5-HMF是麦拉德（Maillard）反应的产物之一，目前，包括5-HMF在内的Maillard反应产物的药理和毒理作用存在较多争议，加之附子本身为毒性中药，因此控制其5-HMF的含量有重要意义。

本研究采用色差仪对附子进行色泽的客观量化，实现了附子的传统性状描写从主观经验向客观量化的转变；在现有研究基础上优化了5-HMF的HPLC含量测定方法^[6-8]，进行了方法学的验证，并进行了附子中5-HMF的HPLC含量测定；进行色泽量化指标与3个单酯型生物碱含量及其总含量、5-HMF含量的相关性分析，发现了它们之间的对应关系，对于全面评价附子的质量提供了科学的依据。