2019, Vol. 39 
表1(Table 1)
艾司奥美拉唑（esomeprazole），也称埃索美拉唑，是奥美拉唑的S-异构体，为质子泵抑制药，也是质子泵抑制剂家族中第1个单一光学异构体[1]。其用于胃食管反流性疾病（GERD）的愈合和症状治疗、防止复发的长期维持治疗、胃溃疡、十二指肠溃疡的治疗。与适当的抗生素联合用药以根除幽门螺旋杆菌，愈合十二指肠溃疡及防止溃疡复发[2]。
杂质E（奥美拉唑氮氧化物，化学名为5-甲氧基-2-[[（4-甲氧基-3，5-二甲基-2-吡啶基）甲基]亚硫酰基]-1H-苯并咪唑）、杂质I（奥美拉唑磺酰氮氧化物，化学名为6-甲氧基-2-[[（4-甲氧基-3，5-二甲基-1-氧代-2-吡啶基）甲基]磺酰基]-1H-苯并咪唑，）和杂质Ⅳ（简称H215，降解氧化产物，化学名为2-[[（5-甲氧基-1H-苯并咪唑-2-基）亚硫酰基]甲基]-3，5-二甲基-4（1H）-1-吡啶酮））是由工艺过程中的副反应产物及艾司奥美拉唑钠在贮存过程中产生，杂质Ⅰ和杂质E属于毒性杂质，现行质量标准[2]中的有关物质检查项中所列杂质未包含这2个杂质。有关物质检查采用HPLC法，方法灵敏度有限，对毒性杂质检查不能满足要求，根据化学药物杂质研究技术指导原则和ICH相关规定[3-5]，并参考有关文献[6-15]，建立了LC-MS/MS法同时测定艾司奥美拉唑的杂质E、杂质I和杂质Ⅳ，为艾司奥美拉唑的质量控制方法提供依据。杂质E、杂质I和杂质Ⅳ的结构式见图 1。
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图 1 杂质E（A）、杂质I（B）和杂质Ⅳ（C）结构式 Fig.1 Structures of impurity E(A), impurity I(B)and impurity Ⅳ(C) |
AB SciexExion LC-QTRAP 4500液相色谱-质谱联用仪（AB SCIEX公司）；XR205SM-DR电子天平（Precisa公司）。
杂质E对照品，，纯度99.5%，LGC公司；杂质I对照品，纯度98.79%，济南蔚然生物科技有限公司；杂质Ⅳ对照品，纯度96.4%，CATO公司。艾司奥美拉唑钠原料药（批号17090801x、17090802x、17090803x，天方药业有限公司）。乙腈为色谱纯，水为超纯水。
2 方法与结果 2.1 色谱条件采用Agela Venusil MP C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，3 μm），柱温35 ℃，以水为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱（0~3.0 min，45%A→30%A；3.0~4.0 min，30%A；4.0~6.0 min，30%A→10%A；6.0~6.1 min，10%A→45%A；6.1~8.0 min，45%A），流速0.2 mL·min-1，进样量1 μL；质谱离子化方式为ESI，负离子模式，CUR（Psi）为25，IS（V）为-5 500，TEM为450 ℃，GS1（Psi）、GS2（Psi）均为55，CAD为Medium，MRM扫描，杂质E检测离子质核比为m/z 360.1→194.0/218.0，杂质I检测离子质核比为m/z 375.8→145.6/210.7，杂质Ⅳ检测离子质核比为m/z 330.2→312.1/193.6。
2.2 溶液的制备 2.2.1 供试品溶液取艾司奥美拉唑钠约10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加30%乙腈水振摇使溶解并稀释到刻度，摇匀，即得。
2.2.2 对照品溶液取艾司奥美拉唑及杂质E、I、Ⅳ的对照品适量，精密称定，分别用30%乙腈水制成每1 mL中约含艾司奥美拉唑1 mg，杂质E 0.037 5 mg，杂质I 0.037 5 mg，杂质Ⅳ 1.0 mg的溶液，作为对照品储备液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ；临用前再各取适量，用30%乙腈稀释制成每1 mL含艾司奥美拉唑1 μg，杂质E 0.037 5 μg，杂质I 0.037 5 μg，杂质Ⅳ 1.0 μg的单一对照品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及混合对照品溶液。
2.3 专属性试验取空白溶液（30%乙腈水），单一对照品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及混合对照品溶液各1 μL，分别注入液相色谱-质谱仪，记录质谱谱图，见图 2、3。结果表明，各色谱峰出峰时间分别为杂质Ⅳ 2.18 min，杂质E 3.00 min，杂质I 3.62 min，艾司奥美拉唑4.45 min。空白溶剂不干扰。各色谱峰之间互不干扰。
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A.艾司奥美拉唑（esomeprazole） B.杂质Ⅰ（impurity Ⅰ） C.杂质Ⅳ（impurity Ⅳ） D.杂质E（impurity E） 图 2 艾司奥美拉唑及各杂质质谱图 Fig.2 MS spectra of esomeprazole and impurities |
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图 3 空白溶剂（A）、混合对照品（B）及样品（C）的MRM测定色谱图 Fig.3 MRM chromatograms of blank solvent(A), mixed reference substances(B)and sample(C) |
精密称取杂质E、I的对照品适量，用30%乙腈水溶解并定量稀释成杂质E质量浓度分别约为1.26、17.9、29.1、38.1和44.8 ng·mL-1，杂质I质量浓度分别约为1.34、22.6、29.4、38.4、45.2 ng·mL-1的混合溶液，精密量取1 μL进样，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标得杂质E、杂质I的回归方程分别为：
| $ \begin{array}{*{20}{l}} {Y = 5 \times {{10}^6}X - 1.6335 \times {{10}^3}\quad r = 0.9947}\\ {Y = 3 \times {{10}^6}X + 1.6486 \times {{10}^3}\quad r = 0.9928} \end{array} $ |
杂质E质量浓度在1.26~44.8 ng·mL-1范围内线性关系良好，杂质I质量浓度在1.34~45.2 ng·mL-1范围内线性关系良好。
精密称取杂质Ⅳ对照品适量，用30%乙腈水溶解并定量稀释成质量浓度分别为18.9、525、840、1 050、1 260 ng·mL-1的溶液，精密量取1 μL进样，记录色谱图，回归方程为：
| $ Y = 1 \times {10^6}X - 4.9107 \times {10^4}\quad r = 0.9914 $ |
杂质Ⅳ质量浓度在18.9~1 260 ng·mL-1范围内线性关系良好。
取线性关系考察用的溶液适量，依次稀释，进样测定，计算杂质E、杂质I、杂质Ⅳ检测下限分别为0.000 38 ng（S/N=5）、0.000 38 ng（S/N=4）、0.002 1 ng（S/N=5）。
2.5 精密度和稳定性试验 2.5.1 精密度取混合对照品溶液（杂质E 37.5 ng·mL-1，杂质I 37.5 ng·mL-1，杂质Ⅳ 1 000 ng·mL-1），连续进样6次，杂质E、杂质I、杂质Ⅳ峰面积均值的RSD（n=6）分别为3.8%、3.9%、3.0%。表明精密度良好。
2.5.2 稳定性取“2.5.1”项下混合对照品溶液，室温（20 ℃）条件下分别在0、1、2、3、4 h进样1 μL，杂质E、杂质I、杂质Ⅳ峰面积均值的RSD（n=5）分别为6.4%、6.6%、16.4%；冷藏条件下（4 ℃）分别在0、1、2、3、4、5、6 h进样1 μL，杂质E、杂质I、杂质Ⅳ峰面积均值的RSD（n=7）分别为6.5%、8.4%、21.6%。结果表明，杂质I和杂质E在室温4 h和冷藏6 h稳定性较好；杂质Ⅳ在室温下0、1、2、3、4 h的峰面积分别为1 319 000、1 413 000、1 156 000、1 079 000、928 100，冷藏条件下0、1、2、3、4、5、6 h的峰面积分别为961 100、1 089 000、920 800、891 600、729 900、624 100、615 400，2种温度条件下峰面积均随着放置时间的延长明显下降，说明该杂质稳定性较差，溶液应临用新制。
2.6 重复性试验取17090801x批样品适量，用30%乙腈水溶解并稀释制成每1 mL中约含杂质E、I均为0.037 5 μg，含杂质Ⅳ为1.0 μg的溶液（100%浓度）。按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，采用外标法以峰面积计算样品中各杂质的回收率，结果杂质E、I、Ⅳ平均回收率（n=6）分别为94.9%、91.9%、98.2%，RSD分别为2.7%、2.3%、2.7%，表明本方法重复性良好。
2.7 加样回收率试验取杂质对照品各适量，精密称定，用30%乙腈水溶解并稀释制成（1）每1 mL中约含杂质E、I均为0.03 μg，含杂质Ⅳ为0.8 μg的溶液（80%浓度）3份；（2）每1 mL中约含杂质E、I均为0.037 5 μg，含杂质Ⅳ为1.0 μg的溶液（100%浓度）3份；（3）每1 mL中约含杂质E、I均为0.045 μg，含杂质Ⅳ为1.2 μg的溶液（120%浓度）3份。精密称取艾司奥美拉唑钠（批号17090801x）约50 mg，9份，分别置于50 mL量瓶中，用上述9份溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算回收率，结果见表 1~3。
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表 1 杂质E回收率测定结果 Tab.1 Results of recovery test of impurity E |
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表 2 杂质I回收率测定结果 Tab.2 Results of recovery test of impurity I |
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表 3 杂质Ⅳ回收率测定结果 Tab.3 Results of recovery test of impurity Ⅳ |
分别取3批艾司奥美拉唑钠原料药样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果见表 4。
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表 4 样品的含量测定结果 Tab.4 Results of determination |
本试验中由于所用液质联用仪器灵敏度较高，对照品溶液和供试品溶液进样1 μL，即能满足实验要求，故进样1 μL。
3.2 质谱检测条件选择由于杂质E、杂质I、杂质Ⅳ与艾司奥美拉唑主成分极性差别较大，且3个杂质均采用负离子模式，主成分采用正离子模式，采用梯度洗脱，使得主成分在所有杂质之后出峰。
3.3 杂质稳定性从稳定性结果可以看出，无论是室温还是低温条件下，杂质E和I的溶液稳定性均较好，而杂质Ⅳ溶液峰面积明显下降，提示供试品溶液应临用新制。
3.4 概述杂质E为奥美拉唑氮氧化物，杂质I为奥美拉唑磺酰氮氧化物，均为潜在基因毒性杂质；杂质Ⅳ为降解氧化产物，其极易吸潮，吸潮后极易变质，现有质量标准的HPLC法测定艾司奥美拉唑钠中的有关物质方法运行时间较长，准确测定该杂质的量有一定困难。现行标准未对杂质E和杂质I限度进行控制，其测定方法目前未见文献报道。选用合适的分析方法，准确地分辨与测定有毒杂质的含量并综合药学、毒理学研究的结果，将其限度控制在一个安全、合理的范围之内，将直接关系到上市药品的质量及安全性。由于杂质E和杂质I在艾司奥美拉唑钠样品中含量较低，而常规高效液相色谱法的灵敏度不能满足要求，不能很好地检测和控制本品的含量，故采用LC-MS/MS法来检测和控制本品，并参考化学药物杂质研究技术指导原则和ICH相关规定，将其限度定为0.003 75%，杂质Ⅳ限度定为0.1%。方法学验证结果表明，该方法检测灵敏度高，专属性强，线性、精密度、稳定性、准确度均满足测定要求，可很好地分离并检测杂质E、杂质I和杂质Ⅳ的含量，为艾司奥美拉唑钠/镁及其制剂的质量控制方法提供参考。
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