2019, Vol. 39 
表1(Table 1)
2. 江西省药品检验检测研究院, 江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心, 南昌 330029;
3. 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所, 北京 100050
2. Jiangxi Institute for Drug Control, Jiangxi Provincial Engineering Research Center for Drug and Medical Device Quality, Nanchang 330029, China;
3. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
没药为橄榄科（Burevaceae）没药属（Commiphora）植物地丁树Commiphora myrrha Egnl.或哈地丁树Commiphora molmol Egnl.的干燥树脂，分为天然没药和胶质没药，主产于索马里与埃塞俄比亚[1]，其质量标准收载于《中华人民共和国药典》2015年版一部[2]。没药药性辛、苦，平，归心、肝、脾经，有特异的香气，在中国以及印度等地具有悠久的用药历史，具有活血、消肿、止痛的功效，主治瘀血心腹诸痛、跌扑伤痛等[3]。没药为常用中药，主要成分为倍半萜和三萜[4]，有关没药质量标准方面研究较少，主要集中于总挥发油成分以及HPLC法测2-甲氧基-5-乙酰氧基-呋喃大根香叶-1（10）-烯-6-酮和2-甲氧基-呋喃大根香叶-1（10）-烯-6-酮的含量[5-8]。本课题组前期从没药中分离得到相对-1S，2S-环氧-4R-呋喃大根香叶-10（15）-烯-6-酮（化合物Ⅰ）、（1（10）E，2R，4R）-2-甲氧基-8，12-环氧大根香叶-1（10），7，11-三烯-6-酮（化合物Ⅱ）和莪术酮（化合物Ⅲ）等倍半萜类化合物。化合物Ⅰ具有神经保护，对乳腺癌细胞株MCF-7有细胞毒的活性[9-10]；化合物Ⅱ抑制前列腺癌细胞的增殖，用于抗菌药物预防和治疗人类免疫缺陷病毒及其他传染病，抗真菌，抑制肿瘤细胞增殖[11-14]等活性；化合物Ⅲ有刺激潜能，镇痛等活性[15-16]。目前尚未有文献报道采用HPLC同时测定上述没药中3个主要成分的含量测定方法。因此，本实验建立了采用RP-HPLC同时测定没药中化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3个倍半萜类化合物含量的测定方法，考察了6批没药药材中3个成分的含量差异，为进一步完善没药药材的质量评价方法提供参考依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器安捷伦公司Agilent 1260型高效液相色谱仪，包括G1311C四元泵、在线脱气机、G1315D DAD、G1329B自动进样器、LC1260色谱工作站、G1316A柱温箱；赛多利斯公司Sartorius BT25S电子天平（十万分之一）、Sartorius BSA124S-CW电子天平（万分之一）；昆山市超声仪器公司KQ-500DE型数控超声波清洗器。
1.2 试药化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的对照品均为本课题组自制，通过1H-NMR、13C-NMR、MS等手段确证了其结构，纯度经HPLC法检测均 > 98%（面积归一法）。乙腈（Sigma公司）为色谱纯，水为Milli-Q超纯水，甲醇及乙醇（国药集团化学试剂有限公司）、磷酸（西陇科学股份有限公司）为分析纯。6批没药药材均购自于药材市场，由周国平主任药师鉴定为地丁树Commiphora myrrha Engl.的干燥树脂。
2 溶液的制备 2.1 混合对照品溶液精密称取化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的对照品适量，加甲醇制得质量浓度分别为0.018 4、0.029 0和0.025 8 mg·mL-1的混合溶液，即得。
2.2 供试品溶液取没药药材粉末（过3号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称量，超声（功率500 W，频率40 kHz）处理0.5 h，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。
3 色谱条件采用资生堂CAPCELL PAK C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0~40 min，41%B；41~60 min，44%B），流速1.0 mL·min-1，检测波长210 nm，进样量10 μL；在上述色谱条件下，样品色谱中与各对照品对应的吸收峰的理论板数均不低于3 000，色谱图见图 1。
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1.化合物Ⅰ（compound Ⅰ） 2.化合物Ⅱ（compound Ⅱ） 3.化合物（compound Ⅲ） 图 1 混合对照品（A）、没药药材（B）HPLC色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and Commiphora myrrha(B) |
精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液1、2、5、10、15、25，分别按“3”项下色谱条件进样分析，以进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得3个成分的线性回归方程，结果见表 1。
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表 1 3个成分的线性关系 Tab.1 Linearity of 3 components |
精密吸取混合对照品溶液5 μL，按“3”项下色谱条件连续进样6次，依次测定峰面积，结果化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰面积的RSD（n=6）分别为0.35%、0.17%、0.11%，表明仪器精密度良好。
4.3 稳定性试验精密吸取供试品溶液10 μL，按“3”项下色谱条件，于0、1、2、4、8、12、24 h分别进样测定，结果化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰面积的RSD（n=7）分别为0.62%、0.70%、0.69%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
4.4 重复性试验取同一批没药药材粉末（过3号筛）6份，各约0.2 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“3”项下色谱条件进样测定，化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的平均含量（n=6）分别为0.791、1.430、1.471 mg·g-1，RSD分别为0.91%、1.1%、0.76%。
4.5 回收率试验精密称取“4.4”项下已测知含量的没药药材粉末（过3号筛）6份，每份约0.1 g，精密称定。每份分别精密加入含3.06 μg·mL-1化合物Ⅰ、5.80 μg·mL-1化合物Ⅱ、5.68 μg·mL-1化合物Ⅲ的混合对照品溶液25 mL，按“2.2”项下方法制备供试溶液，并按“3”项下色谱条件进样测定，计算平均回收率，结果见表 2。
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表 2 回收率试验结果 Tab.2 Results of recovery |
取同一批没药药材粉末（过3号筛）约0.2 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别采用资生堂CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Aglient ZOBAX C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、费罗门Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3种品牌的色谱柱，按“3”项下色谱条件进行测定，结果无明显差别。
5 样品含量测定分别取不同产地的没药药材粉末（过3号筛）各2份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“3”项下色谱条件进行分析，测定峰面积，用外标法计算出化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的含量，结果见表 3。
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表 3 样品含量测定结果（n=2） Tab.3 Results of content determination of samples |
应用DAD检测器在190~400 nm范围内对化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ进行光谱扫描；结果表明，在210 nm波长附近3个成分吸光系数均最大，干扰少且稳定，故选择210 nm作为检测波长。
6.2 供试品溶液制备方法的考察考察了回流提取法和超声提取法对化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ含量测定的影响，结果显示超声提取法方便且能提取完全，故选择超声提取法。提取溶剂考察了乙腈溶液、甲醇溶液、乙醇溶液，结果显示甲醇溶液提取时化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ含量均较高。提取时间考察了0.25、0.5、1.0 h，结果显示0.5 h可提取完全。提取体积考察了15、25、50 mL，结果显示无明显差别，故将提取体积定为25 mL。
6.3 流动相的确定考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-水4个溶剂系统，结果显示以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，所得色谱峰峰形较好，分离效果最佳；同时考察了采用41%乙腈-0.1%磷酸水溶液、42%乙腈-0.1%磷酸水溶液以及本实验的梯度洗脱，结果以41%乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相时化合物Ⅲ出峰时间太晚，以42%乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相时化合物Ⅰ将杂质峰包进去，故采用本实验的梯度洗脱。
6.4 小结本实验对6批不同产地没药药材中化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3个成分的含量进行测定，结果显示不同样品含量差异较大。本文建立了没药中3个主要倍半萜成分的HPLC含量测定方法，色谱峰分离效果较好，基线较平，重现性较好，简便可靠，可为进一步完善没药药材的质量评价方法提供参考依据。
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