2019, Vol. 39 
2. 成都凡微析医药科技有限公司, 成都 610031
2. Chengdu Finelyse Pharmaceutical Technology Co., Ltd., Chengdu 610031, China
替诺福韦（tenofovir，TFV，图 1-A）是一种新型核苷类逆转录酶抑制剂，为目前治疗乙型肝炎病毒感染和人类免疫缺陷病毒感染的一线抗病毒药物。相比以往的抗病毒药物，TFV在有效性、安全性及耐受性等方面均有很大优势[1-3]。然而，由于TFV结构中具有高极性的磷酸基团，导致其生物利用度极差[4-5]。因此，在最初TFV被开发为酯类前药—富马酸替诺福韦二吡呋酯（tenofovir disoproxil fumarate，TDF），以提高其生物利用度，从而用于临床的治疗。虽然TDF具有较高的口服生物利用度，但是，其在酯酶水解后迅速被降解为TFV，过早的水解导致TFV的全身暴露量偏高[6]，引起非靶向性TFV的蓄积。该现象被认为是导致TDF具有长期治疗毒性（肾毒性、骨密度降低等）的主要原因[7]。为了解决该问题，研发人员重新设计了另一种磷酰胺酯前体药物——替诺福韦艾拉酚胺（tenofovir alafenamide，TAF，图 1-B），TAF只对靶细胞中的特异性酶敏感，如外周血单核细胞中的组织蛋白酶A[8-9]及肝细胞中的羧酯酶1[10]。TAF的非靶向稳定性有助于降低全身暴露量并提高靶细胞中TFV[3, 11]的装载量，从而提高该药物的安全性[12]和有效性[3, 13]。
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图 1 TFV（A）和TAF（B）化学结构式 Fig.1 Chemical structures of TFV(A)and TAF(B) |
相比上一代药物，TAF的优点十分显著，使得其快速成为治疗病毒感染的新一代明星药物，但目前有关其血浆检测和药动学的研究报道较少[14-15]。本研究建立了一种简便、快速、准确并且能同时测定人血浆中TAF及其活性代谢物TFV浓度的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）测定方法，该方法可满足对TAF及其代谢产物TFV的临床血药浓度测定需要，为该药临床评价提供药动学参数。
1 仪器、样品和试剂 1.1 仪器TRIPLE QUAD 5500TM LC-MS/MS系统（应用生物系统公司）；SHIMADZU LC-20AD二元泵（岛津公司）；SHIMADZU DGU-14A脱气系统（岛津公司）。
1.2 样品和试剂受试药物：富马酸替诺福韦拉酚胺片（成都倍特药业有限公司，规格25 mg·片-1，批号171102）；参比药物：Vemlidy（美国吉利德科学公司，规格25 mg·片-1，批号011928。TAF对照品（批号TNL-001-062-1，含量88.6%），TFV对照品（批号201507003，含量96.8%），替诺福韦艾拉酚胺-d7（TAF-d7）对照品（内标，批号TNL-032-094-3，含量98.0%），替诺福韦对照品-d6（TFV-d6）对照品（内标，批号TNL-032-091-3，含量98.7%），均由成都倍特药业有限公司提供。甲醇（Sigma公司）、乙腈（Sigma公司）均为色谱级；甲酸（Dikma公司）、三氯乙酸（天津化学试剂公司）均为分析纯；水为去离子水。空白血浆（Bioreclamation IVT公司）由成都凡微析医药有限公司提供。
2 色谱与质谱条件 2.1 色谱条件色谱柱：Capcell pake ADME（75 mm×2.1 mm，5 µm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0 min，10%B；0~0.10 min，80%B；0.11~1.50 min，80% B；1.51~3.50 min，10%B）；流速：0.4 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：5 μL。
2.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源；监测模式：阳离子模式监测；扫描方式：多反应监测（MRM）；监测离子（m/z）：TAF 477.3/346.1，TAF-d7 484.3/346.1，TFV 288.2/176.0，TFV-d6 294.2/182.0；离子喷射电压：5 500 V；温度：500 ℃。
3 系列混合对照品工作液及内标工作液的配制精密称量TAF对照品24 mg，TAF-d7对照品16 mg，分别置于不同的100 mL量瓶中，用80%甲醇溶解并稀释到刻度，即得TAF质量浓度为0.240 0 mg·mL-1和TAF-d7（内标）质量浓度为0.160 0 mg·mL-1的储备液；精密称量TFV对照品24 mg，TFV-d6对照品20 mg，分别置于不同的100 mL量瓶中，用10%甲醇溶解并稀释到刻度，即得TFV质量浓度为0.240 0 mg·mL-1和TFV-d6（内标）质量浓度为0.200 0 mg·mL-1的储备液。储备液于4 ℃保存备用。用50%甲醇稀释TAF储备液成质量浓度为20.00、60.00、400.0、2 000、8 000、12 800、16 000 ng·mL-1的系列TAF对照品工作液和120.0、6 000、12 000 ng·mL-1的TAF质控工作液；用50%甲醇稀释TFV储备液成质量浓度为16.00、32.00、64.00、160.0、400.0、640.0、800.0 ng·mL-1的系列TFV对照品工作液和48.00、300.0、600.0 ng·mL-1的TFV质控工作液，临用时将TAF与TFV的系列工作液一一对应地以1:1的比例混合均匀，得系列混合对照品工作液。用甲醇稀释相应内标储备液成质量浓度为8 000 ng·mL-1 的TAF-d7工作液及400.0 ng·mL-1 的TFV-d6工作液。
4 血浆样品处理精密移取空白血浆95 μL，加入混合对照品工作液及内标工作液各5 μL，涡旋30 s，精密加入乙腈（含1%三氯乙酸）300 μL，涡旋3 min，4 000 r·min-1离心10 min，取上清液200 μL于96孔板中，涡旋1 min后将96孔板置于自动进样器中，进样5 μL，进行HPLC-MS/MS分析。
5 方法学考察 5.1 专属性考察按“2.1”项下色谱条件，对处理后的空白血浆、空白血浆+混合对照品、空白血浆+内标及受试者用药后血浆样品进行测定，结果见图 2。在本实验条件下，TAF、TFV、TAF-d7和TFV-d6的保留时间分别为2.2、0.8、2.2、0.8 min，分离良好，说明该方法的专属性较高，其他内源性物质不干扰检测。
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A.空白血浆（blank plasma）B.空白血浆+TAF和TFV对照品（blank plasma spiked with TAF and TFV reference substances without IS）C.空白血浆+TAF-d7和TFV-d6内标（blank plasma spiked with TAF-d7 and TFV-d6 IS）D.受试者用药后1 h血浆样品、内标（volunteer plasma sample spiked with IS） 图 2 TAF、TFV和内标色谱图 Fig.2 Chromatograms of TAF, TFV and IS |
精密移取相应浓度系列混合对照品工作液5 μL，分别置于95 μL人空白血浆中，制得不同浓度的标准含药血浆样品，按“4”项方法操作，进行分析。以对照品与内标峰面积的比值（Y）为纵坐标、对照品浓度（X）为横坐标进行线性回归，权重系数1/X2。TAF、TFV的线性回归方程分别为：
Y=0.005 26X+0.000 312 r=0.998 9
Y=0.125X+0.076 2 r=0.998 3
结果表明TAF与TFV的血药浓度分别在0.1~400 ng·mL-1及0.4~20 ng·mL-1范围内线性良好，定量下限分别为0.100 0 ng·mL-1及0.400 0 ng·mL-1。
5.3 准确度与精密度试验精密移取人空白血浆95 μL，加入质控工作液5 μL，分别配成TAF低、中、高质量浓度（3.000、150.0和300.0 ng·mL-1）的质控样品各6份，以及TFV低、中、高质量浓度（1.200、7.500和15.00 ng·mL-1）的质控样品各6份，按“4”项方法操作，进行HPLC-MS/MS分析。连续测定3 d，计算准确度及日内、日间精密度。结果见表 1。
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表 1 准确度及精密度试验结果 Tab.1 Analyzing of the accuracy and precision |
按“5.3”项方法分别配制TAF和TFV的低、中、高浓度质控样品，每个浓度平行配制6份，按“4”项方法操作，进行HPLC-MS/MS分析，记录TAF和TFV峰面积（A）；另取空白血浆样品，按“4”项方法（不加对照品和内标）操作，在离心后得到的空白上清液中分别精密加入相应体积的质控工作液及内标工作液，涡旋混匀后进行HPLC-MS/MS分析，记录TAF和TFV峰面积（A0），A/A0×100%即为提取回收率。结果见表 2。
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表 2 提取回收率试验结果（n=6） Tab.2 Analyzing of the extraction recovery |
移取空白血浆，按“4”项方法（不加对照品和内标）操作，选择6个不同来源的空白血浆处理得到空白上清液，在空白上清液中分别精密加入质控工作液及内标工作液，涡旋混合，得到TAF和TFV的低、高浓度含基质样品各6份，进行HPLC-MS/MS分析，记录TAF和TFV峰面积（AX）；另制备相应浓度的TAF与TFV质控工作液直接进行HPLC-MS/MS分析，并记录TAF和TFV峰面积（AS），AX/AS×100%即为基质效应。TAF低、高浓度的绝对基质效应均值分别为101.4%和100.6%，内标归一化基质效应因子分别为0.92和0.92，相对基质效应分别为6.02%和5.23%。TFV低、高浓度的绝对基质效应均值分别为92.3%和80.2%，内标归一化基质效应因子分别为1.12和1.17，相对基质效应分别为3.84%和3.76%。故采用本文方法，TAF、TFV和内标的测定均不受基质效应干扰。
5.5 稳定性试验按“5.3”项方法操作，配制TAF和TFV的低、高浓度质控样品，每个浓度平行配制6份（n=6），分别考察室温稳定性，将样品室温放置8 h；长期稳定性，将样品于-70 ℃放置30 d；冻融稳定性，将样品在-70 ℃和室温下反复冻融4次，每次至少间隔12 h；处理后稳定性，将处理后样品置于进样器（4 ℃）48 h。稳定性质控样品按上述条件分别放置一段时间后，按“4”项方法操作，比较其测定值与0 h质控样品测定值的偏差。考察结果（表 3）表明，TAF和TFV在以上条件下保持稳定。
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表 3 稳定性试验结果（n=6） Tab.3 Results of stability test |
入组健康受试者12例，其中男性11例，女性1例，平均年龄31.8岁，平均体质量58.6 kg，体重指数（21.3±1.3）kg·m-2。实验前体检心、肝、肾等均正常，实验前2周及试验期间未用过任何其他药物，并且试验期间统一饮食，禁烟、酒及含咖啡因的饮料。试验方案经伦理委员会批准。受试者签署知情同意书。
6.2 给药方案受试者第1周期试验前1天清淡晚餐后禁食，次日晨服药前和后1 h禁水，服药4 h后进食统一的标准营养午餐。试验当日早晨空腹服受试药物或参比药物（25 mg·片-1）1片，240 mL温开水送服。给药前0 h（给药前1 h内），给药后5、10、20、30、45 min及1、1.25、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24、48、72 h，取上肢静脉含药血约4 mL至预先标记的K2-EDTA抗凝剂真空采血管中，于2~8 ℃离心机中离心（3 500 r·min-1，10 min），分离血浆。血浆样品及时储存于（-30±5）℃冰箱，采血结束后将样本转移至（-75±15）℃冰箱保存待测。
6.3 药动学参数12例志愿者口服受试药物和参比药物25 mg后的平均血药浓度-时间曲线见图 3，根据血浆中药物浓度计算药动学参数。经Phoenix WinNonlin 7.0统计软件对血药浓度经时数据进行处理，得单剂量口服受试药物与参比药物后的其他药动学参数，见表 4。
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图 3 12名受试者单剂量口服TAF 25 mg后TAF（A）与TFV（B）平均药-时曲线图 Fig.3 The mean concentration-time curves of TAF(A)and TFV(B)in the plasma of 12 subjects after single oral administration of 25 mg TAF tablets |
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表 4 受试者口服TAF 25 mg后的主要药动学参数（x±s，n=12） Tab.4 Main pharmacokinetic features of oral administration of 25 mg TAF |
本试验采用HPLC-MS/MS同时检测人血浆中TAF及其活性代谢产物TFV，具有测定时间较短，专属性好，准确度高等特点，并将该方法成功地应用于健康人体内的药动学研究。曾对沉淀剂进行筛选，本试验选择含1%三氯乙酸乙腈蛋白沉淀法，相较于简单乙腈沉淀，能较好地提高TFV的响应，并增强极性化合物TFV在色谱柱上的保留，该方法可简化样品处理步骤，缩短分析时间，在成批处理上有极大优势。
同TDF相比，富马酸替诺福韦艾拉酚胺中TFV半衰期明显延长，且TAF所需剂量仅约为TDF的1/10，对肾脏的负担较TDF小。目前，国内文献尚无TAF 25 mg单剂量下的药动学报道，本试验报道了TAF片在中国受试者体内25 mg单剂量口服后TAF及其活性代谢物TFV药动学特征，TAF达峰时间为0.5 h左右，达峰时间快，半衰期短，TFV达峰时间较TAF晚，半衰期长，可以为临床用药治疗及使用安全性提供理论依据。
| [1] |
LOVETT GC, NGUYEN T, ISER DM, et al. Efficacy and safety of tenofovir in chronic hepatitis B:Australian real world experience[J]. World J Hepatol, 2017, 9(1): 48. DOI:10.4254/wjh.v9.i1.48 |
| [2] |
PHUNG BC, SOGNI P, LAUNAY O. Hepatitis B and human immunodeficiency virus co-infection[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(46): 17360. DOI:10.3748/wjg.v20.i46.17360 |
| [3] |
RUANE PJ, DEJESUS E, BERGER D, et al. Antiviral activity, safety, and pharmacokinetics/pharmacodynamics of tenofovir alafenamide as 10-day monotherapy in HIV-1-positive adults[J]. J Acquir Immune Defic Syndr, 2013, 63(4): 449. DOI:10.1097/QAI.0b013e3182965d45 |
| [4] |
CUNDY KC, SUEOKA C, LYNCH GR, et al. Pharmacokinetics and bioavailability of the anti-human immunodeficiency virus nucleotide analog 9-[(R)-2-(phosphonomethoxy)propyl]adenine(PMPA)in dogs[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1998, 42(3): 687. DOI:10.1128/AAC.42.3.687 |
| [5] |
SHAW JP, SUEOKO CM, OLIYAI R, et al. Metabolism and pharmacokinetics of novel oral prodrugs of 9-[(R)-2-(phosphonomethoxy)propyl]adenine(PMPA)in dogs[J]. Pharm Res, 1997, 14(12): 1824. DOI:10.1023/A:1012108719462 |
| [6] |
KEARNEY BP, FLAHERTY JF, SHAH J. Tenofovir disoproxil fumarate:clinical pharmacology and pharmacokinetics[J]. Clin Pharmacokinet, 2004, 43(9): 595. DOI:10.2165/00003088-200443090-00003 |
| [7] |
MCCOMSEY GA, KITCH D, DAAR ES, et al. Bone mineral density and fractures in antiretroviral-naive persons randomized to receive abacavir-lamivudine or tenofovir disoproxil fumarate-emtricitabine along with efavirenz or atazanavir-ritonavir:AIDS Clinical Trials Group A5224s, a substudy of ACTG[J]. J Infect Dis, 2011, 203(12): 1791. DOI:10.1093/infdis/jir188 |
| [8] |
BIRKUS G, KUTTY N, HE GX, et al. Activation of 9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(isopropoxycarbonyl)ethyl]amino]phenoxyphosphinyl]-methoxy]propyl]adenine(GS-7340)and other tenofovir phosphonoamidate prodrugs by human proteases[J]. Mol Pharmacol, 2008, 74(1): 92. DOI:10.1124/mol.108.045526 |
| [9] |
BIRKUS G, WANG R, LIU X, et al. Cathepsin A is the major hydrolase catalyzing the intracellular hydrolysis of the antiretroviral nucleotide phosphonoamidate prodrugs GS-7340 and GS-9131[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(2): 543. DOI:10.1128/AAC.00968-06 |
| [10] |
MURAKAMI E, WANG T, PARK Y, et al. Implications of efficient hepatic delivery by tenofovir alafenamide(GS-7340)for hepatitis B virus therapy[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 59(6): 3563. DOI:10.1128/AAC.00128-15 |
| [11] |
CALLEBAUT C, STEPAN G, TIAN Y, et al. In vitro virology profile of Ttenofovir alafenamide, a novel oral prodrug of tenofovir with improved antiviral activity compared to that of tenofovir disoproxil fumarate[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 59(10): 5909. DOI:10.1128/AAC.01152-15 |
| [12] |
SAX PE, ZOLOPA A, BRAR I, et al. Tenofovir alafenamide vs.tenofovir disoproxil fumarate in single tablet regimens for initial HIV-1 therapy:a randomized phase 2 study[J]. J Acquir Immune Defic Syndr, 2014, 67(1): 52. DOI:10.1097/QAI.0000000000000225 |
| [13] |
AGARWAL K, FUNG SK, NGUYEN TT, et al. Twenty-eight day safety, antiviral activity, and pharmacokinetics of tenofovir alafenamide for treatment of chronic hepatitis B infection[J]. J Hepatol, 2015, 62(3): 533. DOI:10.1016/j.jhep.2014.10.035 |
| [14] |
OCQUE AJ, HAGLER CE, MORSE GD, et al. Development and validation of an LC-MS/MS assay for tenofovir and tenofovir alafenamide in human plasma and cerebrospinal fluid[J]. J Pharm Biomed Anal, 2018, 156: 163. DOI:10.1016/j.jpba.2018.04.035 |
| [15] |
HUMMERT P, PARSONS TL, ENSIGN LM, et al. Validation and implementation of liquid chromatographic-mass spectrometric(LC-MS)methods for the quantification of tenofovir prodrugs[J]. J Pharm Biomed Anal, 2018, 152: 248. DOI:10.1016/j.jpba.2018.02.011 |