目前糖尿病已经发展成为严重威胁人类健康的疾病，由于患者胰岛素分泌减少或耐受，引起糖代谢紊乱，形成慢性高血糖症状。中国是全球糖尿病患者第一大国，2015年病患人数高达1亿以上。糖尿病患者的治疗主要通过口服降糖药及注射胰岛素来控制血糖，胰岛素根据起效时间可分为速效、短效、中效和长效胰岛素。丹麦诺和诺德公司（Novo Nordisk）在行业内拥有最为广泛的糖尿病治疗产品，包括德谷胰岛素、门冬胰岛素、利拉鲁肽和索马鲁肽等^[1-2]。德谷胰岛素（insulin degludec）作为新一代的超长效胰岛素，其氨基酸序列与人胰岛素具有很高的同源性，可降低过敏反应的发生^[3-4]。德谷胰岛素发挥作用的持续时间长达42 h^[5]，皮下注射后在注射部位形成胰岛素储库，德谷胰岛素单体与白蛋白的可逆性结合延缓了德谷胰岛素到达靶组织的时间，降低了低血糖发生率^[6]，其药代学特点是不受年龄、肝肾功能的影响，与受体结合及代谢和人胰岛素相同，因此具有良好的安全性。门冬胰岛素是一种重组胰岛素类似物，由天冬氨酸代替人胰岛素氨基酸链的β28位脯氨酸而产生，注射后15 min起效，作用可持续3~5 h^[7]。利拉鲁肽是一种胰高血糖素样肽（GLP-1）类似物，与人GLP-1具有97%的序列同源性，皮下注射后的吸收比较缓慢，在给药后8~12 h达到最大浓度，作用持续时间为24 h，适合每天1次的给药方案。索马鲁肽是GLP-1受体激动剂，与人GLP-1具有94%的序列同源性，它能够刺激胰岛素分泌，降低高血糖素分泌，与血白蛋白结合半衰期为1周，适合每周1次给药方案。

目前虽然有国外进口的胰岛素类降糖药，但由于糖尿病人需要定期注射胰岛素，长期治疗的费用相对来说比较昂贵，因此国内不少公司也在加紧研制胰岛素类降糖药^[8]。在胰岛素类降糖药的效价或葡萄糖耐量研究中，传统的葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法（GOD-POD法）可以测定血糖值，但步骤繁多，费时费工，若采用大型生化仪则用血量较大，操作复杂，价格昂贵，而采用血糖仪则用血量少，操作简便，价格便宜。血糖仪的原理主要分为2种：光化学法和电化学法，其中光化学法血糖仪价格较便宜，但探测头暴露在空气中易污染，测试误差为±0.8。而电化学法血糖仪可避免污染，误差仅为±0.2；其原理是通过测量血液中的葡萄糖与试纸中的葡萄糖脱氢酶反应产生的电流量进而测量血糖，该方法符合国际ISO 15197-2013标准，并配有质控液，可检验血糖仪和试纸是否使用正常；该血糖仪能自动保存500个测试结果，包含检测时间和日期等，存储的血糖结果可通过软件或红外数据线将保存的结果传输到电脑上。

本文采用血糖仪法检测血糖值，适用于德谷胰岛素和门冬胰岛素的生物活性研究以及利拉鲁肽、索马鲁肽的葡萄糖耐量研究。实验结果，表明采用血糖仪检测血糖值仅需6 μL微量采血，不到1 min即可完成1次检测，测量5 s快速出结果，操作十分简便，采用质控液校准后血糖值的准确性高，重复性好，适用于胰岛素类药物的研究。

1 仪器、试药及动物 1.1 仪器

Accu-Chek Performa卓越精采型血糖仪，罗氏公司；ACQUITY Arc System高效液相色谱仪，Waters公司；SpectraMax M5酶标仪，MD公司。

1.2 样品及主要试剂

TRESIBA^®（insulin degludec injection）100 U·mL^-1德谷胰岛素注射液（lot：FP51541；GP51461；FS6Y381）均由Novo Nordisk公司生产。德谷胰岛素（CA501）制剂（lot：D20171203；标示量：100 U·mL^-1）、CA501空白制剂（lot：KB20171201）、德谷胰岛素（CA501）原料药（lot：D170901CG）及利拉鲁肽注射液（批号：C20180802）均由重庆宸安生物制药有限公司生产。门冬胰岛素原料药（lot：R502171213C）、索马鲁肽（批号：R505181212C）均由上海博唯生物科技有限公司生产。门冬胰岛素标准品（批号：410011-201501），购自中国食品药品检定研究院。血糖仪配套血糖试纸（批号476009），罗氏公司。葡萄糖测定试剂盒（葡萄糖氧化酶法）（批号：51809033），德赛诊断系统（上海）有限公司。

1.3 动物

昆明小鼠，SPF级，雄性，出生日期相近，体质量20~26 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号SCXK（京）20016-0006。

2 方法与结果 2.1 德谷胰岛素生物学活性研究 2.1.1 试验条件

取昆明小鼠，按体质量随机分成4组，每组10只，逐只编号，各组小鼠分别腹部皮下2点，每点0.1 mL，共计每只0.2 mL，注射用pH 2.50生理盐水分别稀释的高或低剂量标准品TRESIBA^®德谷胰岛素注射液或CA501供试品溶液，给药后40 min尾部采血，用血糖仪测血糖值，第1次给药后间隔40 h以上，按双交叉设计对各个小鼠进行第2次给药，采用血糖仪测定给药后40 min的血糖值，给药方案见表 1。依照生物检定统计法中量反应平行线测定计算效价及实验误差。本法的可信限率（FL%）不得大于25%。

2.1.2 方法学考察 2.1.2.1 特异性

取小鼠20只，分为2组，每组10只，给药前尾部采血，用血糖仪检测血糖值；小鼠腹部皮下2点，每点0.1 mL，共计每只0.2mL分别注射pH 2.5的生理盐水与用pH 2.5生理盐水稀释至0.4 U·mL^-1 TRESIBA^®德谷胰岛素溶液，给药后40、90 min分别尾部采血用血糖仪测血糖值。结果给药前平均血糖值为（9.9±0.8）mmol·L^-1，注射pH 2.5的生理盐水40、90 min的平均血糖值分别为（10.2±1.2）、（9.9±0.9）mmol·L^-1，注射0.4 U·mL^-1 TRESIBA^®德谷胰岛素40、90 min的平均血糖值分别为（5.0±1.2）、（3.6±1.0）mmol·L^-1，表明注射样品稀释液pH 2.5生理盐水无降糖作用，而注射0.4 U·mL^-1 TRESIBA^®德谷胰岛素溶液后40、90 min的血糖值分别下降49%、64%。故TRESIBA^®德谷胰岛素具有降糖特异性。

用纯化水配制约40 mg·mL^-1的蔗糖和质量浓度约2、0.5 mg·mL^-1葡萄糖溶液，采用血糖仪插入血糖试纸测定血糖值，结果蔗糖未测出血糖值，而2、0.5 mg·mL^-1葡萄糖溶液的血糖值分别为26.7、6.8 mmol·L^-1，这是因为血糖试纸中葡萄糖脱氢酶对葡萄糖具有高度特异性，而对双糖蔗糖没有反应，故血糖仪法测血糖值具有葡萄糖检测的特异性。

2.1.2.2 精密度试验

取小鼠3只，分别于给药前及给药（0.4 U·mL^-1 TRESIBA^®德谷胰岛素溶液）后40、90 min眼眶采血，3 000 r·min^-1离心10 min，得到3个小鼠血清样品，采用血糖仪重复测定，每个血样10次，血糖值的RSD分别为2.1%、1.7%、1.5%，结果表明血糖仪检测血糖值重复性较好，精密度较高。

2.1.2.3 线性关系考察试验及定量下限、检测下限测定

取“2.1.2.2”项下给药前采血制得的血清样品，用纯化水按2倍比稀释制成不同浓度的溶液并用血糖仪测定血糖值，结果见表 2；以浓度（X）为横坐标，以血糖值（Y）为纵坐标，得线性回归方程：

Y=10.892X+0.276 1   R²=0.999 6

结果表明，血糖值在0.6~11.2 mmol·L^-1范围内与浓度线性关系良好，定量下限为0.6 mmol·L^-1，根据罗氏卓越精采型血糖仪使用说明书，血糖值的检测范围为0.6~33.3 mmol·L^-1，因此血糖值的检测下限为0.6 mmol·L^-1。

2.1.2.4 相关性考察

按照葡萄糖测定试剂盒（葡萄糖氧化酶法）说明书，取上述实验中采血离心后的血清样本（或试剂盒中标准品）10 μL，加入葡萄糖氧化酶试剂200 μL，37 ℃温育10 min。检测波长为508 nm，采用SpectraMax M5酶标仪读吸收度值，根据吸收度与标准品浓度制成的标准曲线来计算血清样本中葡萄糖的浓度。同时应用血糖仪测定小鼠血清样本的血糖值，采用SPSS统计软件比较2种方法检测的血糖值，结果表明2种方法显著相关（γ=0.866，P < 0.01）。

2.1.2.5 稳定性试验

德谷胰岛素（CA501）制剂、德谷胰岛素（CA501）原料药用CA501空白制剂溶解成质量浓度为3.66 mg·mL^-1供试品溶液，于2~8 ℃分别放置7 d，采用HPLC法进行分析。色谱条件：采用Thermo公司Hypersil GOLD色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.05%三氟乙酸水溶液（A）-0.05%三氟乙酸乙腈溶液（B）为流动相，梯度洗脱[0 min，A-B（72:28）；30 min，A-B（45:55）]，流速1.0 mL·min^-1，柱温40 ℃；检测波长214 nm，进样量1 μL。德谷胰岛素（CA501）制剂、德谷胰岛素（CA501）原料药主峰面积的RSD分别为0.5%和0.8%，说明供试品溶液在7 d内稳定性良好。

2.1.2.6 样品测定

取德谷胰岛素（CA501）制剂（lot：D20171203）和德谷胰岛素（CA501）原料药（lot：D170901CG），以TRESIBA^®德谷胰岛素注射液作为标准品，采用血糖仪测定小鼠血糖值，计算效价。结果表明，德谷胰岛素（CA501）（lot：D20171203）分别用3批TRESIBA^®德谷胰岛素注射液为标准品的效价结果分别为97.3、108.1、91.6 U·mL^-1，均在（100±10）U·mL^-1范围内，FL%分别为13.5%、18.9%、15.2%；德谷胰岛素（CA501）原料药（lot：D170901CG），采用TRESIBA^®德谷胰岛素注射液（lot：FP51541）为标准品的结果为34.1 U·mg^-1 ，FL%为19.4%。

2.2 门冬胰岛素生物学活性研究

取昆明小鼠，按体质量随机分成4组，每组5只，逐只编号，各组小鼠分别腹部皮下2点，每点0.1 mL，共计每只0.2 mL，门冬胰岛素标准品或原料药先用含2 mg·mL^-1苯酚的pH 2.5生理盐水配制成20 U·mL^-1，再用pH 2.5生理盐水稀释至高（0.25 U·mL^-1）或低剂量（0.125 U·mL^-1）门冬胰岛素标准品或原料药溶液，给药后40 min尾部采血用血糖仪测定血糖值。第1次给药后间隔24 h后，按双交叉设计对各个小鼠进行第2次给药，采用血糖仪测定给药后40 min的血糖值，给药方案见表 3。结果门冬胰岛素原料药（长期稳定性12个月）的效价为22.3 U·mg^-1，FL%为20.8%。

2.3 利拉鲁肽和索马鲁肽葡萄糖耐量研究

取小鼠18只，按体质量随机分成3组，每组6只，逐只编号，分别给药利拉鲁肽（剂量320 μg·kg^-1）、索马鲁肽（剂量320 μg·kg^-1）和空白对照（10 mmol·L^-1磷酸盐缓冲液，pH 7.4），在给药后24、48、72、96 h分别腹腔注射40%葡萄糖0.2 mL，注射前及注射后15、30、60 min尾静脉采血，用血糖仪测定血糖值，评价给药后小鼠葡萄糖耐量情况。结果表明，与空白对照相比，利拉鲁肽、索马鲁肽在给药后24、48、72、96 h注射葡萄糖15 min及30 min时仍有明显降糖作用，结果见图 1。

3 讨论 3.1 小鼠给药剂量的选择

给药剂量：调节剂量，使低剂量能引起小鼠血糖明显下降，高剂量不致引起血糖过度降低，高、低剂量间引起的血糖下降有明显差别。比较德谷胰岛素0.1、0.2、0.4、0.8 U·mL^-1的降糖结果分别为12%、33%、54%、72%。小鼠的体质量对免疫剂量的影响也比较明显，体质量较重则降糖作用会降低，体质量较轻则降糖作用会增加。例如：40只小鼠第1次、第2次给药时体质量分别为（24.3±1.0）、（27.9±1.3）g，昆明鼠体质量2 d增加约3.6 g，所以第1次给药的剂量选择低、高剂量分别为0.2、0.4 U·mL^-1。另外，由于季节、室温与德谷胰岛素降糖作用有密切关系，给药剂量的选择也需要按季节、室温而变，夏天室温较高时降糖作用较为敏感，试验过程中应保持室温的恒定。根据1年来多次的试验结果发现，德谷胰岛素常用的高剂量一般为0.3~0.5 U·mL^-1。对于门冬胰岛素摸索了剂量0.125、0.25、0.5 U·mL^-1，发现0.5 U·mL^-1时容易导致小鼠低血糖（血糖值低于2.7 mmol·L^-1），故门冬胰岛素高剂量可选择0.2~0.3 U·mL^-1。

3.2 小鼠给药数量的比较

采用每组10只（双交叉法）小鼠对于CA501制剂和CA501原料药的检验结果和可信限率FL%均在要求范围内，因此适用于CA501制剂和CA501原料药生物活性的测定；对于CA501原料药，标准规定为每1 mg的效价不得少于15 U，实验结果显示每组5只（双交叉法）效价P_T结果偏差在5%，虽然实验误差略高一些，但可以减少一半的小鼠数量，符合动物保护原则，满足对实验动物减少、替代、优化要求。若初检不合格，再采用每组10只（双交叉法）进行复检，以准确测定效价，因此每组5只（双交叉法）也可用于CA501原料药生物活性的测定。同样在门冬胰岛素效价测定中采用了每组5只（双交叉法），FL%为20.8%（小于25%），符合检测要求。

3.3 血糖测定方法的比较

传统葡萄糖氧化酶-过氧化酶法（GOD-POD法）一般需要取全血几百微升，并且还需分离血清，对血清进行一定的稀释，步骤繁多，更容易增加实验误差^[9-10]。本实验采用血糖仪检测小鼠的血糖值，具有较好的特异性、精密度、线性关系等，并且采用尾部取血操作简便，所需血量极少（0.6 μL），检验快速（6 s），实验过程中可以确定给药剂量是否合适，当供试品出现高、低给药剂量不能满足实验要求，可及时调整给药剂量，节省实验时间，避免实验失败，提高检验效率，减少实验误差。另外，在利拉鲁肽和索马鲁肽葡萄糖耐量受研究中，由于小鼠在0、15、30、60 min共4次取血，如果采用传统葡萄糖氧化酶-过氧化酶法，从实验操作上很难在短时间内完成，多次取血量较大，取血时间也较长，并且对小鼠影响较大，也容易影响实验结果的准确性，故适宜采用血糖仪检测小鼠的血糖值进行葡萄糖耐量的研究。

致谢: 感谢上海博唯生物科技有限公司吴玲和重庆宸安生物制药有限公司唐颖在德谷胰岛素生物学活性研究中的帮助！感谢上海中医药大学实验动物中心的支持和帮助！