2019, Vol. 39 
胆汁酸是胆汁的重要组成成分，由胆固醇在肝细胞中合成而来。初级胆汁酸在合成后被分泌到胆囊，随后进入肠道，在肠道微生物的作用下通过氧化、脱羟基、去结合等反应生成次级胆汁酸。游离型胆汁酸能够进一步与甘氨酸、牛磺酸等结合形成相应的结合型胆汁酸[1]。胆汁酸的生理功能主要是影响饮食中脂质吸收，除此以外，还能够作为信号分子激活特异性受体。这些胆汁酸受体被特异性结合后不仅能够改变胆汁酸组成，也对维持机体脂质代谢、葡萄糖代谢以及能量代谢起着至关重要的作用[2]。
正常人体胆汁中有5种游离型胆汁酸，主要是胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、少量石胆酸及微量熊脱氧胆酸，每种游离型胆汁酸均能与甘氨酸和牛磺酸结合形成相应的结合型胆汁酸。肝脏及肠道多种生理及病理性因素能够影响胆汁酸代谢及转运，导致体内总胆汁酸水平及胆汁酸谱发生变化[3]。目前临床上主要以血清总胆汁酸浓度作为急慢性肝炎、肝硬化以及妊娠期肝内胆汁淤积症等肝脏疾病的诊断指标[4]，在国内医疗机构中将胆汁酸分型检测技术作为常规检测项目的开展尚不成熟。总胆汁酸浓度检测虽然简便快捷，但检测结果对疾病的诊断及治疗的指导作用有限，对于某些疾病进程的诊断，个别胆汁酸浓度的变化往往具有更高的诊断灵敏度。
本研究旨在建立简便、灵敏、快速的高效液相色谱质谱联用法测定人血中5种游离型胆汁酸—胆酸、鹅去氧胆酸、熊脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸以及其相应的甘氨酸结合型和牛磺酸结合型共15种胆汁酸的浓度，并进一步比较血清、肝素锂抗凝血浆及EDTA-K2抗凝血浆中15种胆汁酸检测的差异，为开展胆汁酸分型检测提供技术支持。
1 仪器与试剂 1.1 仪器API-4000型三重四极杆串联质谱仪（Applied Biosystem Sciex公司），1200系列高效液相色谱仪（Agilent公司）。Analyst1.4.2数据处理系统（Applied Biosystem Sciex公司）。
1.2 试剂胆酸（CA，批号SLBH1420V，纯度≥98%）、去氧胆酸（DCA，批号BCBQ4388V，纯度≥98%）、鹅去氧胆酸（CDCA，批号MKBS2816V，纯度≥97%）、熊去氧胆酸（UDCA，批号SLBQ1474V，纯度≥99%）、石胆酸（LCA，批号BCBS3684V，纯度≥95%）、牛磺胆酸（TCA，批号SLBQ5062V，纯度≥98%）、牛磺去氧胆酸（TDCA，批号SLBR0659V，纯度≥98%）、牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA，批号SLBR7538V，纯度≥97%）、牛磺熊去氧胆酸（TUDCA，批号026M4184V，纯度≥98%）、牛磺石胆酸（TLCA，批号SLBQ8462V，纯度≥98%）、甘氨胆酸（GCA，批号SLBR1284V，纯度≥97%）、甘氨去氧胆酸（GDCA，批号BCBN5741V，纯度≥97%）、甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA，批号SLBM3327V，纯度≥97%）、甘氨熊去氧胆酸（GUDCA，批号BCBR4054V，纯度≥96%）以及2，2，3，4，4-5氘代石胆酸（D5-LCA，批号SH1094V，纯度≥98%）均购自Sigma-Aldrich公司；甘氨石胆酸（GLCA，批号1-TMH-13-4，纯度≥98%）购自TRC公司。甲醇和乙腈为色谱纯（Merck KGaA公司），HPLC用水为Milli-Q超纯水系统所制，醋酸铵为分析纯。
2 方法与结果 2.1 液相色谱-质谱条件 2.1.1 色谱条件采用Xterra RP 18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），Phenomenex Security GuardTM C18预柱（4 mm×3.0 mm），以10 mmol·L-1醋酸铵水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱，程序见表 1，流速1 mL·min-1，进样量10 μL。
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表 1 梯度洗脱程序 Tab.1 The programed elution gradient |
采用电喷雾离子源，负离子检测，扫描方式多反应监测（MRM），电喷雾电压-4 200 V，碰撞气压力27.6 kPa，气帘气压力206.9 kPa，雾化气压力344.8 kPa，辅助气压力344.8 kPa，离子源温度500 ℃。15种胆汁酸及内标优化后的参数及保留时间见表 2。
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表 2 15种胆汁酸保留时间及质谱条件 Tab.2 The retention time and the mass spectrum conditions for MS detection of 15 bile acids |
精密称取每种胆汁酸对照品各约10 mg，分别置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得质量浓度均为1 mg·mL-1的标准曲线储备液；将15种胆汁酸的标准曲线储备液混合后用甲醇-水（1:1，v/v）稀释，即得各胆汁酸质量浓度均分别为10、25、50、150、500、1 500、5 000、15 000、30 000 ng·mL-1的系列混合标准曲线工作液。
2.2.2 胆汁酸质控储备液及混合质控工作液精密称取每种胆汁酸对照品各约10 mg，分别置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得质量浓度均为1 mg·mL-1的质控储备液；将15种胆汁酸的质控储备液混合后用甲醇-水（1:1，v/v）稀释，即得各胆汁酸质量浓度均分别为25、500、4 000、25 000 ng·mL-1的混合质控工作液。
2.2.3 内标储备液及内标工作液精密称取D5-LCA对照品约10 mg，置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得质量浓度为1 mg·mL-1的内标储备液，并用甲醇-水（1:1，v/v）进一步稀释得到质量浓度为10 μg·mL-1的内标工作液。
2.3 空白血浆的制备人血浆样本中存在的内源性胆汁酸会对方法学的建立产生干扰，因此制备空白血浆时需采用活性炭对这些内源性胆汁酸进行吸附处理。具体的处理方法：取肝素锂抗凝人血浆加入活性炭，配制成活性炭质量浓度为0.1 g·mL-1的血浆混悬液，涡旋1 h使其充分接触吸附，于4 ℃，13 000 g离心10 min，取上悬液过滤得到本实验所需空白血浆。
2.4 血浆样本处理方法吸取200 μL血浆样本至1.5 mL塑料离心管中，加入内标工作液10 μL后再加入400 μL乙腈沉淀蛋白，涡旋1 min，于4 ℃，20 000 g离心10 min，取上清至1.5 mL塑料离心管中，用真空浓缩仪在65 ℃下挥干溶剂，并以100 μL甲醇-水（1:1，v/v）复溶，涡旋1 min，最后于4 ℃，20 000 g离心10 min，取上清至进样瓶中，最终进样10 μL进行分析测定。
2.5 方法学考察 2.5.1 特异性取200 μL空白血浆，不加内标，按“2.4”项下方法操作，记录LC-MS/MS图（图 1-A）。取空白血浆180 μL，加入20 μL的4 000 ng·mL-1的胆汁酸混合质控工作液后涡旋混匀，配制成各胆汁酸质量浓度为400 ng·mL-1的质控血浆样品，按“2.4”项下方法操作，记录LC-MS/MS图（图 1-B）。结果显示，空白血中各胆汁酸出峰位置无内源性干扰，内标及各胆汁酸测定无相互干扰。取1名体检者肝素锂抗凝血浆处理后进样所得的LC-MS/MS图见图 2。本测定方法具有较高的特异性，能够用于人血中15种胆汁酸的测定。
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A.空白血浆（blank plasma）B.各胆汁酸质量浓度为400 ng·mL-1的质控血浆样品+内标工作液（quality control plasma samples for each bile acid at 400 ng·mL-1+internal standard working solution） 图 1 15种胆汁酸的提取离子流图 Fig.1 The chromatograms of extracted ion current for the 15 bile acids |
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图 2 体检者肝素锂抗凝血浆LC-MS/MS图 Fig.2 The LC-MS/MS analyzing of the heparin anticoagulative plasma from volunteers |
取空白血浆180 μL，加入胆汁酸混合标准曲线工作液20 μL后充分涡旋混匀，配制成各胆汁酸质量浓度均分别为1、2.5、5、15、500、150、500、1 500、3 000 ng·min-1的标准曲线血浆样品，按“2.4”项下方法操作，记录各胆汁酸峰面积与内标峰面积。以各胆汁酸峰面积As与内标峰面积Ai比值Y为纵坐标，各胆汁酸浓度X为横坐标，进行权重回归（权重系数为1/X2），回归曲线方程、线性范围、相关系数见表 3。结果显示，LCA、TLCA以及GLCA的线性范围为1~500 ng·mL-1，其余胆汁酸线性范围为1~3 000 ng·mL-1，浓度与峰面积的比值具有良好的线性关系，标准曲线各浓度点实测值的RE均在±15%以内，相关系数（r2）的值在0.985 9~0.997 6之间。
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表 3 各胆汁酸线性范围，回归方程以及相关系数（r2） Tab.3 The linear ranges, regression equations and correlation coefficients(r2) for each bile acid |
取空白血浆180 μL，加入胆汁酸混合质控工作液20 μL，分别配制2.5、50、400、2 500 ng·mL-1 4个浓度的质控血浆样品，每个浓度平行配制6份。按“2.4”项下方法操作，每天1批，连续测定3 d。每批随行1条标准曲线，记录各胆汁酸峰面积与内标峰面积。各胆汁酸低、中、高3个浓度质控血浆样品批内和批间RSD均小于10%，RE均在±15%内，具体结果见表 4。
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表 4 批内、批间精密度与准确度，提取回收率以及基质效应数据（n=6） Tab.4 Precision and accuracy, recovery and matrix effect of inter- and intra-day data |
样品A：取各胆汁酸质量浓度为25、500、4 000、25 000 ng·mL-1的胆汁酸质控工作液20 µL，分别加入内标工作液10 µL以及甲醇-水（1:1，v/v）70 µL，每个浓度平行制备6份，涡旋混匀后取样10 µL，进行LC-MS/MS分析，记录各胆汁酸和内标的色谱峰面积A。样品B：取“2.3”项配制的空白血浆200 μL，共24份，不加内标，按“2.4”项下方法处理[复溶液（甲醇-水（1:1，v/v）100 µL由上述样品A（共4个浓度，每个浓度平行制备6份）代替]，并进行LC-MS/MS分析，记录各胆汁酸和内标的色谱峰面积B。样品C：按“2.4”项下方法配制各胆汁酸质量浓度分别为2.5、50、400和2 500 ng·mL-1的质控样本后进行LC-MS/MS分析，记录各胆汁酸和内标的色谱峰面积C。以各胆汁酸及内标峰面积B与A的比值作为待测物与内标的基质因子，并计算各胆汁酸的基质因子与内标的基质因子之比，作为内标归一化的基质效应因子；以各胆汁酸及内标峰面积C与B的比值计算提取回收率。各胆汁酸基质效应及提取回收率的结果见表 4，所有低、中、高浓度提取回收率在71.2%~93.5%，内源性基质对待测物以及内标的影响程度在生物样本分析的要求范围内。
2.5.5 稳定性配制2.5、50、400、2 500 ng·mL-1的质控血浆样品，将同一浓度水平的质控血浆样品混合均匀并分装成若干份，每份200 μL。①第1批，每个浓度各3份，按“2.4”项下方法处理后放置于自动进样器72 h，进样分析；②第2批，每个浓度各3份，于室温放置24 h后按“2.4”项下方法操作；③第3批，每个浓度各3份，于-30 ℃冰箱中反复冻融3次后按“2.4”项下方法操作；④第4批，每个浓度各3份，于-80 ℃冰箱中冷冻保存90 d后按“2.4”项下方法操作。最终根据每批随行标准曲线计算稳定性样本实测值。最终结果见表 5，各胆汁酸稳定性样本实测浓度与理论浓度的RE均在±15%之内，表明人血浆中胆汁酸在各种储存条件中稳定性良好。
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表 5 胆汁酸稳定性数据 Tab.5 Stability analysis of the bile acids |
经苏州大学附属第二医院伦理委员会批准，取6名体检者空腹抽取2 mL静脉血于无抗凝剂的分离胶采血管、肝素锂抗凝采血管及EDTA-K2抗凝采血管中，肝素锂和EDTA-K2抗凝样品轻柔颠倒混匀后立即于4 ℃，1 800 g离心10 min分离血浆；无抗凝剂样品于4 ℃，1 800 g离心10 min分离血清。按上述建立的LC-MS/MS方法检测血浆及血清中15种胆汁酸，计算血清、肝素抗凝血浆及EDTA-K2抗凝血浆中每种胆汁酸浓度及RE。所有胆汁酸RE范围见表 6，6名体检者血清与2种抗凝剂血浆中所有胆汁酸的RE范围在-19.54%~19.56%之间。将6名体检者各胆汁酸的平均RE值在散点图（图 3）上分布后，观察到血清和肝素锂抗凝血浆中的检测结果接近，而EDTA-K2抗凝血浆的检测结果偏高。
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表 6 6名体检者血清、肝素锂抗凝血浆及EDTA-K2抗凝血浆中胆汁酸RE范围 Tab.6 RE ranges of the bile acids in serum, heparin anticoagulative plasma and EDTA-K2 anticoagulative plasma from 6 volunteers |
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图 3 6名体检者肝素锂抗凝血浆、EDTA-K2抗凝血浆以及血清中各胆汁酸平均RE散点分布图 Fig.3 The RE scatter plot of 15 bile acids in serum, heparin anticoagulative plasma and EDTA-K2 anticoagulative plasma from 6 volunteers |
胆汁酸是一类由胆固醇合成的具有甾体骨架的两亲性分子，人体内胆汁酸在肝脏中合成后，于进餐后作为胆汁的重要组成成分，辅助机体进行脂类物质消化，排入肠道内的胆汁酸约有95%会经门静脉重吸收进入肝脏[5]，进而被肝脏重吸收，形成胆汁酸的肠肝循环。健康人群中胆汁酸池的大小是相似的，各种生理或病理因素影响胆汁酸的合成、运输以及肠肝循环，均可导致人体血浆中胆汁酸组成及含量发生相应变化。近年来，胆汁酸对机体的信号调控作用被证明与多种疾病的发病机制相关联，如胆汁淤积[6]、糖尿病[7]、炎症性肠病[8]、非酒精性脂肪肝[9]等。虽然总胆汁酸检测作为临床上一项常规诊断其应用十分广泛，但在特定疾病的诊断过程中，个别胆汁酸浓度指标的变化往往更具有临床意义。如血清中鹅脱氧胆酸的浓度变化能够作为慢性主动脉周围炎的临床诊断指标[10]；脱氧胆酸及石胆酸在大肠癌患者的粪便中较健康人具有更高浓度[11]；甘氨结合型胆酸检测在肝胆疾病的临床诊断中相比于其他指标具有更高的灵敏度[12]等。因此，开展胆汁酸分型的检测，有利于了解机体胆汁酸代谢及对相关疾病的临床诊治。然而，人体内各种游离及结合型胆汁酸的化学结构相似，且同分异构体较多，极性相差很大，部分胆汁酸在血浆中浓度较低，因此对于胆汁酸分型的定量检测极为困难[4]。
国内已有文献报道人体血清中15种胆汁酸的测定方法，罗镧等[13]采用氯霉素作为内标，方法中各胆汁酸及内标的保留时间在2.41~5.90 min，这种方法虽然使各胆汁酸出峰时间提前，使得样本进样时间缩短，但采用这种方法后可能产生较大的基质效应，从而对测定的影响较大。目前文献中对血中胆汁酸测定的前处理方法主要有固相萃取法[14]和沉淀蛋白法[15]，本实验选用乙腈直接沉淀蛋白的方法，相比于固相萃取法操作简单、快速，所需血浆样本及溶剂较少，适用于大批量样本的测定。实验初期进行色谱条件的摸索，流动相尝试了30%乙腈进行等度洗脱，虽然各胆汁酸能够分离完全，但LCA、TLCA、GLCA等保留时间较长。随后进行色谱条件的优化，于16~23.5 min提高流动相中有机相比例，使得LCA、TLCA、GLCA等疏水性组分出峰时间提前，最终得到本文中的梯度洗脱程序，15种胆汁酸及内标的检测时间控制在30 min，同时各胆汁酸能够很好地进行分离。选用氘代内标，相比于氯霉素内标，同位素内标与待分析胆汁酸的物理性质及化学性质更接近，能够将血浆样本前处理及进样分析过程中所产生的误差降到最低。本文中采用的方法线性良好，精密度与准确度符合定量分析要求，方法提取回收率高，最低定量限能够达到1 ng·mL-1，能够很好地用于临床样本的测定。
本研究对6名体检者的血清、肝素抗凝血浆及EDTA-K2抗凝血浆样本进行15种胆汁酸的定量检测，进一步比较血清、肝素锂抗凝及EDTA-K2抗凝后的检测结果，发现血清和血浆样本中所有胆汁酸分离良好，基线平稳，不同抗凝剂对胆汁酸保留时间没有影响，血清与2种抗凝剂的血浆中所有胆汁酸的RE在±20%以内（-19.54%~19.56%），提示本研究建立的方法能够用于血清样本、肝素锂抗凝血浆样本及EDTA-K2抗凝血浆样本中15种胆汁酸的定量检测。血清中15种胆汁酸的RE为-12.11%~4.67%，肝素锂抗凝血浆中15种胆汁酸的RE为-13.08%~2.08%，EDTA-K2抗凝血浆中15种胆汁酸的RE为-0.26%~15.46%，提示血清与肝素锂抗凝的检测结果相近，而EDTA-K2抗凝的结果普遍偏高。因此，用本研究所建立的检测方法在临床开展15种胆汁酸分型检测时，可以采用血清或肝素锂抗凝样本进行检测。
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