2019, Vol. 39 
大黄素为蒽醌类成分，在蓼科植物大黄、何首乌、虎杖、首乌藤中含量较高，为其主要药效成分之一，此外在豆科、百合科、鼠李科等植物中也有分布。大黄素药用价值广，具有多种生物活性，可抗炎，抗菌，止咳，降血压，泻下及保护肝脏等[1-3]。然而，随着深入研究，发现大黄素也具有一定的毒性作用，如可导致小鼠肾脏毒性[4]，诱导多种肿瘤细胞凋亡[5-7]等。此外，有文献表明，应用中药何首乌及决明子等所致的肝损伤也与大黄素相关，主要表现为转氨酶升高，黄疸及总胆红素异常升高等症状[8]。
胆红素是人体内一种非常重要的内源性物质，主要在肝脏由其唯一代谢酶UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）代谢为水溶性结合型葡萄糖醛酸结合物，外排至胆汁中。UGT1A1活性被抑制，可导致胆红素肝内堆积，继而引发肝毒性[9]。本研究以介导胆红素代谢的UGT1A1为切入点，考察大黄素对该酶的影响，从而推测其潜在肝毒性作用。由于肝内代谢主要包含Ⅰ相和Ⅱ相代谢2个重要环节，因此本文采用体外肝微粒体孵育方法，首先启动Ⅱ相代谢，考察大黄素原型对UGT1A1的影响，阐明原型成分的肝毒性风险；其次，为了更加真实地模拟体内肝代谢，单独启动Ⅰ相代谢，以及同时启动两相代谢，将代谢产物的因素涵盖进去，进一步阐明大黄素的潜在毒性作用及作用机制。本实验将从代谢角度阐明大黄素引起肝损伤的风险大小，可能机制，以及潜在毒性物质，实验结果将为临床合理用药提供借鉴。
1 仪器与试药 1.1 实验仪器Waters XevoTMQ-TOF/MS质谱系统（Waters公司）；Waters AcquityTM Ultra Performance LC超高效液相色谱仪（Waters公司），METTLER TOLEDO AE240型电子天平（千分之一，梅特勒-托利多公司），Thermo 17R型高速低温离心机（Thermo公司），节能型职能恒温槽SDC-6（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
1.2 材料与试剂大鼠肝微粒体（rat liver microsomes，RLM；雌雄混合）购自BD Gentest公司；磷酸钾（纯度≥98%）、氯化镁（纯度≥98%）、抗坏血酸（纯度≥98%）、三羟甲基氨基甲烷（Tris，纯度≥98%）、氧化型辅酶Ⅱ（NADPNa2）（纯度≥98%）、D-葡萄糖-6-磷酸二钠（G-6-P）（纯度≥98%）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶V（G-6-PDH）（纯度≥98%）均购自百灵威科技，葡萄糖二酸单内酯（纯度≥98%）、丙甲菌素（纯度≥98%）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA，纯度≥98%）、二甲基亚砜（DMSO，纯度≥98%）均购自Sigma Aldrich公司。
大黄素（批号110756-201512，含量98.7%）、胆红素（批号100077-201206，含量99.3%）均购自中国食品药品检定研究院。
甲酸、盐酸均为分析纯（北京化学试剂厂），乙腈、甲醇均为色谱纯（Fisher公司）。
2 方法与结果 2.1 色谱-质谱条件 2.1.1 色谱条件分析柱：Acquity UPLC HSS T3 C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~7 min，95%A→50%A；7~10 min，50%A→20%A；10~11 min，20%A~0%A）；流速：0.4 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：1 μL。
2.1.2 质谱条件电喷雾离子源：ESI；扫描模式：负离子模式；毛细管电压：1.0 kV；锥孔电压：30 V；扫描范围：m/z 50~1 000；去溶剂气流量：600 L·h-1，去溶剂温度：450 ℃；锥孔气流量：50 L·h-1；源温度：110 ℃；采用亮氨酸脑啡肽m/z 556.277 2精确校准分子质量，达到5×10-6的精度要求。
2.2 溶液的配制 2.2.1 Tris-HCl缓冲液精密称取Tris 121.1 g，加入去离子水800 mL，加浓盐酸调pH 7.4，以超纯水定容至1 000 mL，即得。
2.2.2 UDPGA再生系统精密称取氯化镁、葡糖二酸单内酯、丙甲菌素、UDPGA适量，加Tris-HCl缓冲液使溶解，使含氯化镁5 mmol·L-1，葡糖二酸单内酯5 mmol·L-1，丙甲菌素25 μg·mL-1，UDPGA 5 mmol·L-1，即得。
2.2.3 还原型辅酶Ⅱ（NADPH）生成系统精密称取NADPNa2、G-6-PDH、G-6-P、MgCl2适量，置100 mL量瓶中，加超纯水使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（系统中含有1 mmol·L-1 NADPNa2，20 mmol·L-1 G-6-P，2 U·L-1 G-6-PDH，20 mmol·L-1 MgCl2，现用现配）。
2.3 温孵体系 2.3.1 Ⅰ相反应[10]取RLM，以新鲜配制的UDPGA再生系统稀释，肝微粒体体系蛋白质量浓度0.5 mg·mL-1，分别加入不同浓度大黄素及胆红素的DMSO溶液[反应终体积200 μL，DMSO总用量不超过1%（v/v）]，置37 ℃恒温水浴预孵育3 min后加入NADPH生成系统100 μL，于反应15 min后加入600 μL冰乙腈-甲醇（2:1，含抗坏血酸浓度为200 μmol·L-1）终止反应，同时沉淀蛋白，涡旋1 min，于13 000 r·min-1（r=5 cm）离心25 min，取上清液1 μL进行UPLC测定。每个样本重复3次。
2.3.2 Ⅱ相反应[10]取RLM，以新鲜配制的UDPGA再生系统稀释，肝微粒体体系蛋白质量浓度0.5 mg·mL-1，分别加入不同浓度大黄素及胆红素的DMSO溶液[反应终体积200 μL，DMSO总用量不超过1%（v/v）]，置37 ℃恒温水浴预孵育3 min后加入UDPGA再生系统（使含UDPGA终浓度为5 mmol·L-1），于反应15 min后加入600 μL冰乙腈-甲醇（2:1，含抗坏血酸浓度为200 μmol·L-1）终止反应，同时沉淀蛋白，涡旋1 min，于13 000 r·min-1（r=5 cm）离心25 min，取上清液1 μL进行UPLC测定。每个样本重复3次。
2.3.3 Ⅰ、Ⅱ两相反应取RLM，以新鲜配制的UDPGA再生系统稀释，肝微粒体体系蛋白质量浓度0.5 mg·mL-1，分别加入不同浓度顺式、反式二苯乙烯苷及胆红素的DMSO溶液[反应终体积200 μL，DMSO总用量不超过1%（v/v）]，置37 ℃恒温水浴预孵育3min后加入UDPGA再生系统和NADPH生成系统各50 μL（使含UDPGA终浓度为5 mmol·L-1），于反应15 min后加入600 μL冰乙腈-甲醇（2:1，含抗坏血酸浓度为200 μmol·L-1）终止反应，同时沉淀蛋白，涡旋1 min，于13 000 r·min-1（r=5 cm）离心25 min，取上清液1 μL进行UPLC测定。每个样本重复3次。
2.4 酶抑制实验考察[10]按“2.3.2”及“2.3.3”项下所述方法，分别以胆红素的总代谢产物生成量对胆红素底物浓度作图，以米氏方程双倒数作图法测定，横坐标为底物胆红素浓度的倒数（1/S；S代表底物浓度，图中以[S]表示），纵坐标为加入不同浓度大黄素后胆红素代谢反应速率的倒数（1/v）；不同浓度对应不同曲线，以不同曲线的斜率对应大黄素浓度[I]绘制slop图，求得抑制常数Ki；分别考察大黄素以原型（仅启动Ⅱ相代谢反应）形式直接作用，及经过Ⅰ、Ⅱ相代谢后，代谢产物对UGT1A1的综合影响。结果见图 1及表 1。由实验结果可知，仅启动Ⅱ相代谢反应时，大黄素以原型形式直接作用于UGT1A1，对其产生较强的抑制作用（Ki=10.01 μmol·L-1），抑制类型为竞争型抑制；当同时启动Ⅰ、Ⅱ相代谢后，大黄素经由Ⅰ相代谢，代谢产物与原型同时作用于UGT1A1，抑制作用减弱（Ki=72.58 μmol·L-1），抑制类型为竞争型抑制。因此初步推测，大黄素原型可使UGT1A1活性降低，导致其底物胆红素体内蓄积，继而存在引发肝毒性的可能，然而经由Ⅰ相代谢后，大黄素代谢产物使得抑制作用减弱，毒性风险降低。
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A1、A2.启动Ⅱ相代谢后大黄素对UGT1A1动力学影响（effect of emodin on UGT1A1 kinetics after initiation of phase Ⅱ metabolism） B1、B2.启动Ⅰ、Ⅱ相代谢后大黄素对UGT1A1动力学影响（effect of emodin on UGT1A1 kinetics after initiation of phases Ⅰ and Ⅱ metabolism） 图 1 大黄素原型及代谢产物对UGT1A1动力学影响 Fig.1 The impact on UGT1A1 kinetic parameter after adding emodin in RLM |
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表 1 大黄素对UGT1A1的影响（n=3） Tab.1 The impact on UGT1A1 kinetic parameter after adding emodin |
按上述实验方法，将大黄素分别启动Ⅰ相代谢，及同时启动Ⅰ、Ⅱ相代谢，采用Waters Masslynx 4.1软件采集代谢产物信息（保留时间，精确相对分子质量，母离子及二级离子碎片信息），将数据导入UNIFI数据库进行分析，采用scitific library功能对代谢产物进行推测。结果见图 2~5及表 2、3。分析实验结果发现，大黄素仅启动Ⅰ相代谢后，其主要代谢产物为大黄素母核上5个不同活性位点发生的氧化加成产物（图 3、5，M1~M5，m/z 285，表 2）；而同时启动Ⅰ、Ⅱ相代谢反应后，除可少量检出Ⅰ相代谢产物外，主要为大黄素母核活性位点发生的葡萄糖醛酸化代谢产物（图 4、5，M6~M8，m/z 445，表 3），以及大黄素氧化物进一步于活性位点发生的葡萄糖醛酸化代谢物（图 4、5，M9~M13，m/z 461，表 3）。因此，由代谢产物可推测出大黄素肝代谢环节为首先经由Ⅰ相代谢生成以氧化加成为主的代谢产物，继而，大黄素原型及大黄素Ⅰ相氧化产物进一步经由Ⅱ相代谢，生成相应的葡萄糖醛酸化代谢产物。
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A. RLM B.大黄素加入空白RLM（emodin in RLM）C.大黄素加入空白RLM后启动Ⅰ相代谢反应（emodin in RLM after initiation of phase Ⅰ metabolism）D.大黄素加入空白RLM后启动Ⅱ相代谢反应（emodin in RLM after initiation of phase Ⅰand Ⅱ metabolism） 图 2 大黄素RLM孵育试验总离子流图 Fig.2 The Q-Tof information of emodin under the negative mode in RLM incubation system |
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M1~M5.大黄素氧化物（oxidation product of emodin） 图 3 大黄素Ⅰ相代谢产物 Fig.3 PhaseⅠ metabolites of emodin |
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M6~M8.大黄素葡萄糖醛酸化物（glucuronide of emodin）M9~M13.大黄素氧化物的葡萄糖醛酸化物（glucuronide of emodin oxide） 图 4 大黄素Ⅱ相代谢产物 Fig.4 Phase Ⅱ metabolites of emodin |
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M1~M5.大黄素氧化物（oxidation product of emodin）M6~M8.大黄素葡萄糖醛酸化物（glucuronide of emodin）M9~M13.大黄素氧化物的葡萄糖醛酸化物（glucuronide of emodin oxide） 图 5 RLM中大黄素主要代谢途径 Fig.5 Major metabolic pathways of emodin in RLM |
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表 2 大黄素Ⅰ相代谢产物 Tab.2 Phase Ⅰ metabolites of emodin |
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表 3 大黄素Ⅱ相代谢产物 Tab.3 Phase Ⅱ metabolites of emodin |
由于大黄素广泛存在于临床常用中药大黄、何首乌、首乌藤、决明子、虎杖中，且含量较高[12-14]，因此针对大黄素可能产生毒性风险的研究将对临床合理用药具有实际的指导意义。
本文从代谢酶角度展开研究，以UGT1A1介导的胆红素代谢受阻可引发肝毒性风险为出发点，通过体外方法测定大黄素对Ⅱ相代谢酶UGT1A1的抑制作用，从而推测其肝毒性风险[15-17]。实验首先启动Ⅱ相代谢反应，考察大黄素未经Ⅰ相代谢的原型成分对UGT1A1的直接作用，结果提示，原型成分对UGT1A1存在较强抑制，可引发胆红素堆积继而产生肝毒性风险。考虑到某些药物可能同时经过Ⅰ相、Ⅱ相代谢，且这2个通路可能会是竞争性的平行反应，又或者Ⅰ、Ⅱ两相代谢物可分别对Ⅰ、Ⅱ两相代谢通路产生促进或抑制作用，故单独监测NADPH或者UDPGA依赖的通路都可能会导致一定的偏差，不能代表体内的真实生物转化情况，应同时启动两相代谢反应[18-20]。因此，实验同时启动Ⅰ、Ⅱ两相代谢，结果显示大黄素抑制作用变为弱抑制，分析代谢产物发现，大黄素首先经由Ⅰ相代谢后主要发生氧化反应，于母核5个活性位点进行羟基加成，继而Ⅰ相代谢物及大黄素原型经由Ⅱ相代谢，于活性位点进一步发生葡萄糖醛酸化反应，代谢产物极性增大，有利于外排体外。结合酶抑制试验结果，可初步得出以下结论：大黄素原型可对UGT1A1产生较强抑制作用，为潜在肝毒性成分；大黄素经由体内Ⅰ、Ⅱ两相代谢后，代谢产物及原型的共同作用使得抑制作用降低，因此提示Ⅰ相代谢可有效降低大黄素的肝毒性风险。
综上，本研究尝试从代谢酶角度进一步阐释大黄素的潜在肝毒性风险及可能的毒性作用机制。试验结果初步证明大黄素体内Ⅰ相代谢可能为其主要的减毒途径，临床用药应注意避免与Ⅰ相代谢酶抑制剂的联合用药，从而可有效避免肝毒性风险。
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