2019, Vol. 39 
过敏是一种机体的变态反应，是人对过敏原的一种不正常的反应。过敏反应的发生有过敏原这一外因，还有人机体免疫功能低下，大量自由基对肥大细胞和嗜碱粒细胞的氧化破坏这一内，两者因共同作用。目前过敏的治疗方法多为药物治疗，包括氨基醚类、乙二胺类、三环类、丙胺类和哌嗪类和哌啶类等。随着生活水平的提高，大众对于一些具有辅助功能的保健食品越来越关注。保健食品属于食品范畴，对人体机能有一定的调节作用，但不以治疗为目的。
近年来，一些企业为市场占有，在抗过敏类中成药及保健食品中非法添加化学成分。国家食品药品监督管理局发布了保健食品中添加概率较高的几类组分的补充批件，包括镇静安眠类、降糖类、抗风湿类、降压类等。患者在不知情的情况下服用这些所谓的“保健品”后，与自身治疗药物合并，造成药物滥用，不但达不到治疗效果，反而有可能引起药物过量损伤肝脏，产生毒性反应，甚至会危及生命[1]。
目前针对非法添加的化学成分检测方法很多，有理化反应法、拉曼光谱法[2-4]、高效液相色谱法[5-6]、液相色谱-串联质谱法[7-8]、离子迁移谱法[9-10]、近红外光谱法[11]等，其中液相色谱-串联质谱法因其灵敏度高、抗干扰能力强应用最为广泛。目前大多数非法添加化学成分的提取采用甲醇超声提取，提取液基质复杂，对检出浓度影响较大，因此，样品提取及净化显得非常重要。目前抗过敏组分仅马来酸氯苯那敏被列入到国家食品药品监督管理局规定的药品检验补充检验方法和检验项目批准件中的非法添加化学成分中，仅有少量关于非法添加抗过敏组分的研究，且研究仅限于马来酸氯苯那敏[12]。
本研究采用固相萃取技术，以Oasis MCX固相萃取柱净化样品，建立了超高效液相色谱-三重四极杆质谱同时检测中成药及保健食品中17个非法添加抗过敏类化学成分的方法，实现了多种类基质多组分的同时定性、定量分析，方法满足复杂基质的高灵敏度检测要求。
1 仪器与试药 1.1 仪器岛津LC-MS8050，配有电喷雾离子源（ESI）（岛津公司）；Milli-Q超纯水器（Millipore公司）；KQ5200V超声波清洗器（功率200 W，频率40 kHz，昆山市超声仪器有限公司）；METTLER XS205DU电子天平（精度0.01 mg，Mettler Toledo公司）。
1.2 试剂乙腈、甲醇（色谱级，Merck公司）；乙酸铵（分析纯，TCI公司）；乙酸（质谱级，ACS公司）；氨水（分析纯，纯度≥99.9%）；Waters Prime HLB固相萃取柱（规格3 cc/60 mg，沃特世科技有限公司），Waters Oasis MCX混合型阳离子交换固相萃取柱（规格3 cc/60 mg，沃特世科技有限公司）。
1.3 对照品对照品信息见表 1。
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表 1 17个化学成分对照品信息 Tab.1 Information of 17 reference substances for the chemical components |
色谱柱：Waters BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）；流动相A为甲醇、流动相B为0.1%氨水溶液；流速0.3 mL·min-1；柱温40 ℃；进样量1 µL，梯度洗脱（0~2 min，30%B；2~5 min，30%B→10%B；5~10 min，10% B；10~10.01 min，10%B→30%B；10.01~13 min，30%B）。
离子源：电喷雾（ESI）离子源，正离子或负离子模式；离子源温度：250 ℃；毛细管电压：3.5 kV；干燥气流量：10 L·min-1；鞘气温度：250 ℃；雾化气流速：10 L·min-1；检测方式：多反应监测（MRM）。17个化学成分的质谱参数见表 2。
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表 2 17个化学成分质谱参数 Tab.2 MS parameters of 17 chemical components |
色谱柱：大赛璐CHIRALPAK AGP柱（150 mm×4 mm，5 μm）；流动相：乙腈-10 mmol·L-1乙酸铵溶液（6.5:93.5）；流速：0.5 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：1 µL。
2.2 对照品储备溶液的制备 2.2.1 单一对照品储备液精密称取各对照品适量，用甲醇溶解并稀释成终浓度为0.5 mg·mL-1（14个化学成分）、0.1 mg·mL-1（盐酸曲吡那敏）、0.25 mg·mL-1（盐酸西替利嗪、盐酸左西替利嗪）溶液，即得。置-4 ℃冰箱中保存备用。
2.2.2 混合对照品溶液（临用现配）精密量取各单一对照品储备溶液适量，用甲醇稀释成每1 mL含盐酸苯海拉明约5 μg，含盐酸安他唑啉、盐酸曲吡那敏、阿司咪唑、盐酸去氯羟嗪、特非那定约10 μg，含盐酸异丙嗪、盐酸西替利嗪、非索非那定约20 μg，含富马酸氯马斯汀、地氯雷他定、富马酸酮替芬约20 μg，含茶苯海明、盐酸赛庚啶、氯雷他定、马来酸氯苯那敏约50 μg的溶液，作为混合对照品储备溶液。
2.3 供试品溶液的制备 2.3.1 16个化学成分分离系统样品提取：精密称取固体样品0.2~0.3 g（片剂研细混匀，硬胶囊剂取内容物混匀，软胶囊取1次服用剂量），或精密量取溶液2.0~3.0 mL（液体样品取样前摇匀），置10 mL量瓶中，加入甲醇适量，超声提取处理20 min，放冷至室温后，用甲醇定容至刻度，摇匀，0.45 µm滤膜过滤。精密量取续滤液1.0 mL，加9.0 mL 2%甲酸水溶液混匀，待净化。
净化：将上述待净化液转移至Waters Oasis MCX小柱中，待溶液完全通过后，用水3 mL淋洗，抽至近干，用5%氨化甲醇5 mL洗脱、抽干，收集洗脱液，经0.22 µm滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.3.2 西替利嗪与左西替利嗪样品提取：同“2.3.1”。
净化：将上述待净化液转移至Waters Oasis MCX小柱中，待溶液完全通过后，用水3 mL淋洗，抽至近干，用5%氨化甲醇2 mL洗脱，抽干，收集洗脱液，精密量取洗脱液0.5 mL，置10 mL量瓶中，用0.25%乙酸溶液稀释至刻度，摇匀，经0.22 µm滤膜过滤，即得测液。
2.4 测定方法分别精密吸取“2.2项下”混合对照品溶液和“2.3项下”供试品溶液注入液相色谱质谱联用仪测定，记录色谱图，混合对照品色谱图见图 1。
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图 1 17个抗过敏化学成分总离子流图 Fig.1 Total ion chromatograms of 17 kinds of anti-allergic chemical components |
分别精密量取“2.2”项下制备的对照品储备溶液适量，用样品相同的溶剂[（16个化学成分系统溶剂为5%氨化甲醇、西替利嗪与左西替利嗪手性系统溶剂为5%氨化甲醇-0.25%乙酸溶液（5:95）]稀释，配制6个浓度点的系列混合对照品溶液；分别精密吸取适量系列混合对照品溶液，注入液相色谱-质谱联用仪进行测定，以峰面积Y为纵坐标，对照品质量浓度（X，ng·mL-1）为横坐标进行线性回归。见表 3，17个化学成分在各自线性范围内线性关系良好。
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表 3 17个化学成分的线性方程、相关系数及检测下限 Tab.3 Linear equations, correlation coefficients and LODs of 17 chemical components |
精密量取混合对照品溶液适量，加入至空白样品中，照“2.3”项下处理样品，在选定的色谱条件下进样分析，以S/N=3确定检测下限（LOD），结果见表 3。
2.7 加标回收率及重复性试验精密称取不含目标化学成分的样品，分别添加低、中、高3个浓度水平的混合对照品溶液，每个浓度水平平行6份，照“2.3”项下制备供试溶液。进样测定并计算17个化学成分的平均加标回收率和RSD，见表 4。重复性试验与加标回收率试验一致，即同一条件下采用同样的样品相同的加标方式。
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表 4 回收率试验结果（n=6） Tab.4 Results of recovery tests |
精密吸取“2.7”项下3个浓度点的加标溶液，连续进样6次，测得17个化学成分峰面积的RSD均小于5%，结果表明仪器精密度良好。
2.9 稳定性试验取标准曲线次高点的混合对照品溶液，室温环境中放置0、1、2、4、8、10 h各测定1次，分别计算17个化学成分峰面积的RSD，12 h内RSD均小于10%，表明2个系统的溶液在10 h内基本保持稳定。
2.10 样品分析基于上述方法的建立，精密称取市售32批次样品，照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱及质谱条件进行测定，以标准曲线法定量计算样品含量，结果见表 5。
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表 5 样品含量测定结果（n=3） Tab.5 Results of sample determination |
由于甲醇对17个化学成分的溶解性均较好，考虑到甲醇是极性较大的有机溶剂，样品浸润能力较好，故选择甲醇作为样品提取溶剂。超声提取时间考察了10、20和30 min，综合考虑样品的浸润时间和提取效率，最终超声时间选择为20 min。
3.1.2 固相萃取小柱的选择为了获得较干净的供试品溶液，本实验用固相萃取的方式处理样品。固相吸附剂能够将液体中的目标化学成分吸附，与样品的基体和干扰化学成分分离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离和富集的目的。17个化学成分均属于有机碱类，分子结构基本上都含有O、N、S等电负性的杂原子。样品固相萃取净化考察了Oasis Prime HLB萃取柱和Oasis MCX混合型阳离子交换固相萃取柱：Oasis Prime HLB萃取柱具有较强反相吸附作用力；Oasis MCX混合型阳离子交换固相萃取柱兼有离子吸附和反相吸附混合作用力，适用于碱性化学成分pKa值2~10。因常规色谱柱无法将西替利嗪与左西替利嗪分开，故考察固相萃取小柱时，将两者作为1个化学成分合并计算。将样品溶液与酸溶液混合，能够使化学成分带电，带有电荷的化学成分靠静电吸引到带有电荷的吸附剂表面。采用Oasis Prime HLB萃取柱16个化学成分平均回收率在55.5%~129.3%，特别是非索非那定，回收率仅为55.5%；采用Oasis MCX萃取柱平均回收率在79.5%~108.2%，符合分析的要求，见图 2。这与Oasis MCX萃取柱具备2种结合能力有关。本实验还比较了甲醇提取液与不同浓度的甲酸水溶液（1%、2%、4%及8%）混合制备待净化溶液（见图 3）以及用水、20%甲醇、30%甲醇、40%甲醇淋洗（见图 4）5%氨化甲醇及10%氨化甲醇溶液洗脱对各化学成分回收率的影响。结果发现，5%氨化甲醇及10%氨化甲醇溶液洗脱固相萃取柱，各个化学成分的回收率无明显差异，结合色谱柱pH适用范围，选择5%的氨化甲醇溶液进行洗脱。通过优化条件，最终选择2%甲酸溶液进行甲醇提取液的酸化，3 mL水淋洗，5 mL 5%氨化甲醇洗脱。
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图 2 2种固相萃取柱提取各化学成分回收率 Fig.2 Recoveries of chemlal components extracted by two kinds of solid phase extraction column(SPE) |
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图 3 不同浓度甲酸水溶液处理后各化学成分回收率 Fig.3 Recoveries of chemlal components treated with different concentrations of formic acid solution |
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图 4 不同类别洗脱液淋洗后各化学成分回收率 Fig.4 Recoveries of compounds treated with different kinds of elution solution |
16个化学成分分离系统，参考最终样品溶液的溶剂为5%氨化甲醇，需选择能耐受较高pH的色谱柱，综合实验室色谱柱使用情况，选择Waters BEH C18柱。西替利嗪与左西替利嗪手性分离系统，鉴于可用于LC-MS系统的手性柱选择范围较少，本实验考察了大赛璐AS-RH柱与AGP柱。AGP柱分离度较AS-RH柱分离度较好，故选用AGP柱进行分离。
3.2.2 流动相的选择由于质谱条件的限制，流动相可选择的水相范围比较窄，常用的包括水、氨溶液、甲酸水溶液、挥发性缓冲盐（乙酸铵溶液）等。甲酸水溶液能够提供质子，增强正离子的响应；氨溶液能够接受质子，提高负离子的响应，但同时对正离子有抑制作用。采用乙腈作为有机相，化学成分出峰均较早，考虑到后续方法学基质的干扰，故放弃乙腈作为有机相；考察甲醇作为有机相，与不同类别水相混合对各化学成分峰形及回收率的影响，当采用甲醇-水为流动相时，特非那定、氯马斯汀、安他唑啉等色谱峰出现严重拖尾、分叉、双峰的现象。
为改善峰形，鉴于17个化学成分中大多采用正离子模式，实验考察了流动相为甲醇-0.1%甲酸溶液时，17个化学成分的峰形，结果发现大多数化学成分响应有所提高，峰形都得到明显的改善，但茶苯海明出现严重分叉现象。茶苯海明为苯海拉明与8-氯茶碱的混合物，8-氯茶碱的含量可间接反映茶苯海明的量。8-氯茶碱出现明显的分叉现象，可能与流动相和样品溶液溶剂pH差异较大，供试品溶液进入色谱柱时在流动相和提取溶剂中保留能力差异较大，出现了二次分配，产生了溶剂效应有关。
考虑到pH差异过大对茶苯海明峰形影响很大，后续考察了甲醇-乙酸铵溶液和甲醇-0.1%氨溶液作为流动相时各化学成分的峰形，以及回收率情况。乙酸铵溶液会抑制某些化学成分的电离，高浓度的乙酸铵溶液在高比例有机相中易析出，堵塞色谱柱，长期使用会降低色谱柱的使用寿命，故本实验仅考察了10 mmol·L-1乙酸铵溶液。甲醇-10 mmol·L-1乙酸铵溶液作为流动相时，8-氯茶碱色谱峰脱尾情况得到了改善，但分叉现象仍存在；甲醇-0.1%氨溶液作为流动相时，17个化学成分均可获得较满意的峰形，回收率也符合检测要求。兼顾17个化学成分峰形以及灵敏度，选用甲醇-0.1%氨溶液为流动相，见图 5。
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图 5 不同类别流动相各化学成分的回收率 Fig.5 Recoveries of chemlal components treated with different types of mobile phases |
西替利嗪与左西替利嗪分离系统，因色谱柱pH耐受范围为4~7，有机相比例不得过15%，水相缓冲盐浓度通常在10~20 mmol·L-1之间。若选用甲醇为有机相，出峰时间较晚，而0.1%氨水溶液pH为10.4，0.1%乙酸水溶液pH为3.4，均超出了手性柱的pH范围。综合色谱柱各方面适用条件，在不影响化学成分灵敏度的前提下，为达到化学成分分离度的要求，最终选择乙腈与10 mmol·L-1乙酸铵作为流动相。
3.3 溶液条件的选择Oasis MCX固相萃取柱包含2种模式，离子交换和反向作用，对碱性化学成分具有高度选择性和回收率。离子交换的原理是样品溶液在2%甲酸溶液酸性作用下，形成带电离子，吸附在固相萃取柱上，经历清洗过程后需采用碱性溶液洗脱，使其目标化学成分以分子的形式从固相萃取柱上洗脱下来。一般选用的洗脱溶液为5%氨化甲醇和10%氨化甲醇2种。前期实验室对2种溶液pH进行了检测，均为11，故选择了合适的色谱柱进行第一系统的检测。然而，在对手性化学成分西替利嗪和左西替利嗪进行分析的过程中发现，手性色谱柱所能耐受的范围为4~7，故不能使用5%氨化甲醇溶液作为溶剂。综合流动相水相系统为乙酸铵溶液，且有机相比例含量为6.5%，故考虑使用甲酸来稀释样品溶液，同时尽量与流动相初始比较较为接近，减少溶剂效应。但若甲酸浓度过高，pH太低，在色谱柱可耐受范围外，稀释倍数过大，则检出限水平过高，大大降低了本方法的灵敏度。综合量瓶的体积，初步设定稀释的最终体积为10 mL。本文考察了0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.25%甲酸与5%氨化甲醇以不同比例混合后的pH，结果发现0.25%甲酸与5%氨化甲醇以95:5的比例混合时条件最为合适，pH在5左右，且有机相比例为4.75%，符合色谱柱的各项要求。
4 结论本研究建立了一种超高效液相色谱-三重四极杆质谱测定中成药及保健食品中17个化学成分的分析方法，优化了色谱质谱条件以及样品提取净化条件。利用建立的液质联用数据库技术对样品进行检测，能在13 min内能同时得到对以上17个化学成分的筛查和定性结果，大大提高了工作效率，可在实际应用中对样品非法添加进行快速筛查。该法简便，灵敏度高，准确可靠，极大地提高了检测效率，为监管相关非法添加提供了有力的技术支持。本方法可目的性的检测此17个化学成分，但由于各个企业非法添加的化学成分具有不确定性，对其类似物易出现漏筛，后续会结合本文所建立的方法及得到的数据建立谱库，以更好地对样品中的非法添加进行筛查。
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