2019, Vol. 39 
表1(Table 1)
2. 南京中医药大学翰林学院, 泰州 225300
2. Hanlin College Nanjing University of Chinese Medicine, Taizhou 225300, China
银杏（Ginkgo biloba L.），又名“白果树”、“公孙树”，是国家重点保护植物，为我国特有的经济植物资源。以银杏叶制成的一类制剂，具有活血化瘀通络的作用，临床多用于瘀血阻络引起的胸痹心痛、中风、半身不遂、舌强语謇，冠心病稳定型心绞痛、脑梗死见上述证候者[1]。银杏叶制剂的原料是银杏叶提取物，其中有效成分包含黄酮类和萜类内酯等，其中萜类内酯类为血小板活化因子及甘氨酸受体特异性拮抗剂，具有广泛的药理作用，在预防、治疗心脑血管疾病及保护中枢神经系统方面显示了较好的市场前景[2-3]。
银杏叶萜类内酯的含量是银杏叶制剂质量控制的关键指标之一，因其在银杏叶中的含量很低，并且紫外吸收较弱，故一般的分析方法很难测定。目前文献报道主要使用高效液相搭配示差折光检测器（RID）、蒸发光散射检测器（ELSD）和质谱检测器（MS）及氢核磁共振（1H-NMR）等方法检测[4-9]。然而各分析方法均存在不足之处：RID检测器不适宜梯度洗脱，影响分离能力且灵敏度较低；ELSD检测器灵敏度低，含量测定方法复杂；MS及1H-NMR的测定方法对仪器要求较高，不易普及。
《中华人民共和国药典》2015年版使用HPLC-ELSD分析银杏内酯采用正丙醇-四氢呋喃-水为流动相，所使用溶剂多为非常规溶剂，且正丙醇的沸点接近100 ℃，在检测器上挥发性不好，容易导致噪音增加，使方法重复性质差。另外，由于ELSD灵敏度较低，使用的对照品量较大。
电喷雾式检测器（CAD）作为一种新型通用检测器，多应用于检测不挥发性或半挥发性物质，尤其适用于皂苷、糖、生物碱、脂等无紫外吸收或弱紫外吸收类化合物成分的分析与检测[10-11]。与ELSD检测器相似，CAD响应值不依赖于分析物的结构[12]，是与分析物颗粒的质量有关，与RID及ELSD检测器相比，具有更高灵敏度。刘丽娜等[13]比较了CAD、ELSD和RID 3种不同检测器检测银杏叶提取物中4个萜类内酯含量，结果证明CAD检测器灵敏度最优，且具有较好的响应一致性。
本文参照文献[13]的方法，建立了4种银杏叶制剂中白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C 4个内酯的含量测定方法，可用于银杏叶制剂的质量控制。
1 材料 1.1 仪器Thermo Ultimate 3000液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司），Coron Veo RS电雾式检测器（赛默飞世尔科技有限公司）；AE200万分之一电子天平（Mettler Toledo公司）；XS105 DC十万分之一电子天平（Mettler Toledo公司）；JL—720 DT超声波清洗器（上海杰理超声仪器有限公司）；SK8200 LHC超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）。
1.2 试药银杏叶总内酯对照提取物（批号610017-201501）和对照品银杏内酯A（批号110862-201310）、银杏内酯B（批号110863-201209）、银杏内酯C（批号110864-201307）、白果内酯（批号110865-201306）均购自中国食品药品检定研究院。色谱甲醇及色谱乙腈购自北京迈瑞达公司。样品信息见表 1。
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表 1 样品信息 Tab.1 Information of samples |
精密称定银杏叶总萜类内酯对照提取物51.73 mg，加甲醇定容至5 mL的量瓶中，作为银杏叶总萜类内酯对照提取物储备液。分别取对照品白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C，加甲醇制成浓度均为0.1 mg·mL-1的溶液。
2.2 供试品溶液的制备 2.2.1 普通片、胶囊及分散片取本品20片（粒），除去包衣（或取内容物），精密称量，研细；取相当于萜类内酯19.2 mg的粉末，精密称量，置具塞瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称量，超声处理（250 W，33 kHz）20 min，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀滤过。精密量取续滤液20 mL，蒸干，残渣加水10 mL，置水浴中温热使溶散，加2%盐酸溶液2滴，用乙酸乙酯振摇提取4次（15、10、10、10 mL），合并提取液，用5%醋酸钠溶液20 mL洗涤容器，用乙酸乙酯10 mL洗涤醋酸钠溶液，与乙酸乙酯提取液及洗液合并，再用水洗涤2次，每次20 mL，合并水液，用乙酸乙酯10 mL洗涤，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至20 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。用0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得。
2.2.2 滴丸取本丸20粒，精密称定，研细，混匀，精密称定0.5 g，用温水10 mL分次溶解，加2%盐酸溶液2滴，照“2.2.1”项下“用乙酸乙酯振摇提取”方法操作，即得。
2.3 色谱条件采用Poroshell 120 SB-C18（150 mm×4.6 mm，2.7 μm），以甲醇（A）-水（B）为流动相，二元梯度洗脱（0~6 min，25%A→28%A；6~28 min，28%A→30%A），流速0.8 mg·mL-1，柱温35 ℃，进样量5 μL，检测器为CAD，载气N2，压力438.5 kPa，雾化温度35 ℃，采集频率10 Hz，滤光片3.6。在本文色谱条件下，色谱图见图 1。
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1.白果内酯（bilobalide）2.银杏内酯C（ginkgolide C）3.银杏内酯A（ginkgolide A）4.银杏内酯B（ginkgolide B） 图 1 银杏叶总萜类内酯对照提取物（A）及银杏叶片A1（B）色谱图 Fig.1 Chromatograms of total reference extractof ginkgo leaves(A) and Ginkgo leaf tablet al(B) |
分别精密吸取“2.1”项下的对照提取物储备液，用甲醇稀释至0.069、0.138、0.276、0.552、0.828、1.104 mg·mL-1，分别注入液相色谱仪，测定峰面积。用对照品质量浓度（X，mg·mL-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线。结果见表 2。
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表 2 4个萜类内酯的线性方程，相关系数，线性范围，检测下限及定量下限 Tab.2 The linear equation, coefficient, linear range, LODs and LOQs of the four terpene lactones |
取“2.1”项下4个对照品溶液，不断稀释，以信噪比S/N=3为基准，测得检测下限，以信噪比S/N=10为基准，测得定量下限，结果见表 2。
2.4.3 精密度试验取“2.4.1”项下0.552 mg·mL-1银杏总萜内酯对照提取物溶液连续进样6次，记录萜类内酯的峰面积。求得白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C峰面积的RSD分别为1.2%，1.49%、1.5%、1.9%，表明实验仪器精密度良好。
2.4.4 重复性试验精密称取各剂型样品6份，按照“2.2”项下方法制备各剂型供试品溶液，按照“2.3”项下方法进样测定，计算其白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的含量及其RSD：在普通片中含量为4.564、3.947、2.316、1.731 mg·片-1，RSD分别为1.0%、1.5%、1.8%、1.8%；在胶囊中含量为5.901、3.524、1.845、1.872 mg·粒-1，RSD分别为1.6%、1.7%、1.4%、1.1%；在分散片中含量为6.241、3.444、1.731、1.744 mg·片-1，RSD分别为1.3%、0.83%、1.4%、1.9%；在滴丸中含量为5.463、4.212、2.362、1.988 mg·片-1，RSD分别为1.7%、1.7%、1.2%、0.75%，表明实验方法在各剂型中重复性较好。
2.4.5 稳定性试验按照“2.2”项下方法制备各剂型供试品溶液，按照“2.3”项下方法分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，计算各萜类内酯成分峰面积的RSD。结果各剂型白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C峰面积的RSD（n=6）分别为1.3%、1.6%、1.6%、1.3%，表明各剂型的供试品溶液在24 h内均稳定。
2.4.6 加样回收率分别取已测定含量的普通片、胶囊及分散片20片（粒），除去包衣（或取内容物），精密称定，研细，取相当于萜类内酯9.6 mg的粉末；滴丸剂取本丸20粒，精密称定，研细，混匀，精密称定0.25 g，分别精密加入相当于取样中萜类内酯含量的混合对照品粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测定结果见表 3。各剂型回收率（n=6）为95.8%~105.3%，RSD为0.79%~2.1%。
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表 3 4种剂型中白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的回收率（n=6） Tab.3 Recoveries of bilobide, ginkgolide A, ginkgolide B, and ginkgolide C in four kinds of ginkgo leaf preparations |
取4种剂型共18批银杏叶系列制剂的样品，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液并测定，不同剂型银杏叶制剂样品中白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C含量测定结果见表 4。
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表 4 18批样品中萜类内酯的含量结果[mg·片（粒、丸）-1] Tab.4 Determination of the content of terpene lactones in 18 batches of samples(mg per tablet or capsule or pill) |
本实验供试品溶液的前处理参考了2015年版《中华人民共和国药典》 [1]银杏叶片及滴丸的萜类内酯提取方法，样品经加盐酸处理，可抑制内酯水解，提高其在乙酸乙酯中的分配率，尽可能除去杂质，使用醋酸钠碱洗使部分萜类内酯转化成盐，水中加醋酸钠可形成同离子效应，降低洗涤时乙酸乙酯在水中的溶解，洗掉一部分杂质。经乙酸乙酯多次提纯，最终到达纯化目的。因CAD检测器灵敏度高于ELSD检测器，故供试品溶液浓度可适当降低。本研究将供试品溶液定容至20 mL，相比原方法定容至5 mL更有利于提高操作准确性。
4.2 色谱条件的选择使用高效液相色谱法测定银杏萜类内酯类成分，所用流动相有四氢呋喃-甲醇-水、甲醇-水、异丙醇-水系统等[14-15]，经实验前期比较发现。甲醇-水系统已可满足4个萜类内酯的分离要求。使用等度洗脱时，样品中易出现小的杂峰干扰，故使用甲醇-水梯度洗脱的方法，可保证银杏内酯A、B、C及白果内酯的分离满足定量要求。且以甲醇为流动相溶剂，相较于四氢呋喃毒性更低，价格便宜，分离速度也更快。
4.3 CAD检测参数的选择本研究同时以白果内酯的信噪比为指标，考察了CAD检测器中的雾化温度、采集频率和滤光片3个参数。分别考察雾化器温度25、35、50 ℃，采集频率1、10 Hz，滤光片0.5、3.6。在雾化器温度35 ℃，采集频率10 Hz，滤光片3.6时，白果内酯信噪比较好。
本实验采用HPLC-CAD方法，使用常规反相色谱溶剂，并且使用灵敏度更高的CAD检测器，为4种银杏叶制剂中萜类内酯的含量测定提供了更加方便准确的检测方法。
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