2019, Vol. 39 
2. 国家药典委员会, 北京 100061
2. Chinese Pharmacopoeia Commission, Beijing 100061, China
萹蓄为蓼科植物萹蓄Polygonum aviculare L.的干燥地上部分，有利尿通淋、杀虫、止痒之功效，常用于治疗热淋涩痛、小便短赤、虫积腹痛、皮肤湿疹、阴痒带下等[1]。据文献报道，黄酮类成分为萹蓄药材中的主要有效成分[2-7]，《中华人民共和国药典》2015年版一部同样以黄酮类成分杨梅苷作为含量测定指标。由于萹蓄药材中所含黄酮类成分较多，杨梅苷仅仅只是其中1个，且含量较低，不足以代表其所含的黄酮类成分，因此考虑以多个成分同步测定来控制萹蓄药材的质量。目前文献报道萹蓄药材中多个黄酮类成分含量测定通常采用对照品对照法[8-9]，但是由于对照品供应和检测成本问题，限制了该方法在实际生产和市场监管等方面的应用。鉴于杨梅苷、萹蓄苷及槲皮苷均为黄酮苷类成分，基本母核属于黄酮醇类，紫外光谱特征基本一致（在352~385 nm波长处均有主要吸收峰），故考虑采用一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）开展萹蓄药材多指标质量控制的研究[10-15]，即只测定其中1个成分（杨梅苷），通过建立该成分与其他指标性成分（萹蓄苷、槲皮苷）间的相对校正因子，计算出其他成分的含量，实现多个成分的同步测定。
1 试药与仪器Dionex Ultimate3000超高效液相色谱系统，Chromeleon工作站；Shimadzu LC-30 AD超高效液相色谱系统，Lcsolution工作站；XP26电子分析天平（METTLER，百万分之一）；A11分析研磨机（IKA公司）；KQ-100型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；Millipore Simplicity-185型超纯水仪（Millipore公司）。
对照品杨梅苷（批号111860-201102）和槲皮苷（批号111538-200504）均购于中国食品药品检定研究院，萹蓄苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号572-30-5）；76批萹蓄药材样品经安徽省食品药品检验研究院张亚中副主任药师鉴定为蓼科植物萹蓄Polygonum aviculare L.的干燥地上部位，样品信息见表 1；乙腈（色谱纯），其他试剂均为分析纯。
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表 1 萹蓄药材样品来源 Tab.1 The source of Polygoni Avicularis Herba samples |
在一定的范围内（线性范围内）成分的量（质量或浓度）与检测器的响应值呈正比关系，即W=f×A。
2.2 （QAMS）方法学研究 2.2.1 色谱条件色谱柱：Phenomenex Kinetex C18（2.1 mm×100 mm，1.7 µm）；流动相：乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B），线性梯度洗脱，洗脱程序见表 2。柱温：45 ℃；流速：0.2 mL·min-1；检测波长：360 nm；理论塔板数以杨梅苷峰计算不低于3 000。上述条件下，各成分色谱分离较好，对照品与供试品色谱图见图 1。
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表 2 梯度洗脱程序 Tab.2 Gradient elution program |
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1.杨梅苷（myricitrin）2.槲皮苷（quercitrin）3.萹蓄苷（avicularin） 图 1 对照品（A）和萹蓄（S25）（B）色谱图 Fig.1 UPLC chromatograms of reference substances(A)and Polygoni Avicularis Herba(B) |
分别精密称取杨梅苷、萹蓄苷和槲皮苷对照品4.840、5.046、4.628 mg置同一10 mL量瓶中，用60%乙醇水溶解制成含杨梅苷48.4 mg·L-1、萹蓄苷50.46 mg·L-1和槲皮苷46.28 mg·L-1的混合对照品储备液，保存于4 ℃冰箱中，备用。
2.2.3 供试品溶液的制备取萹蓄药材，粉碎，过4号筛，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇水50 mL，称量，冷浸8 h，超声处理（功率300 W，频率45 kHz）30 min，再称量，用60%乙醇水补足减失的量，摇匀，滤过，药渣用适量60%乙醇水洗涤，合并滤液和洗液，置蒸发皿中，蒸干，用60%乙醇水溶解残渣，并转移至10 mL量瓶中，加60%乙醇水至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.2.4 线性范围分别精密量取0.5、1、2.5、5、7.5、10 mL混合对照器储备液，置同一10 mL量瓶中，以60%乙醇稀释到刻度，制得不同浓度的混合含对照品溶液。分别精密量取不同浓度系列混合对照品溶液10 µL，按照“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积。分别以对照品溶液质量浓度X为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，进行线性回归。杨梅甘、萹蓄苷及槲皮苷的回归方程分别为：
Y=0.226 2X+0.024 6 r=0.999 8
Y=0.275 9X+0.039 2 r=0.999 9
Y=0.202 2X+0.031 2 r=0.999 9
结果表明：杨梅苷在2.42~48.4 mg·L-1浓度范围内线性关系良好，检测下限为0.11 mg·L-1；萹蓄苷在5.523~50.46 mg·L-1浓度范围内线性关系良好，检测下限为0.13 mg·L-1；槲皮苷在2.314~46.28 mg·L-1浓度范围内线性关系良好，检测下限为0.07 mg·L-1。
2.2.5 精密度试验取同一份供试品溶液（S25），连续进样6次，每次进样10 µL。杨梅苷、萹蓄苷和槲皮苷峰面积的RSD分别为0.6%、1.7%、0.40%，结果表明仪器进样精密度良好。
2.2.6 重复性试验取同一供试品（S25）粉末，分别按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，测定并记录峰面积。样品中杨梅苷、萹蓄苷及槲皮苷含量的平均值分别为0.196%、0.084%、0.065%，RSD分别为1.5%、0.90%、1.7%。结果表明本法重复性良好。
2.2.7 稳定性试验取新制备的供试品溶液（S25），室温下放置，分别在0、1、2、4、6、8、12、24 h进样测定，杨梅苷、萹蓄苷及槲皮苷峰面积的RSD分别为0.70%、0.90%、1.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.2.8 回收率试验取6份已知含量的萹蓄药材（S25）粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入含杨梅苷95 mg·L-1、萹蓄苷38 mg·L-1和槲皮苷32 mg·L-1的混合对照品溶液10 mL，按“2.2.3”项下操作，进样测定，计算加样回收率。结果见表 3。
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表 3 杨梅苷、萹蓄苷及槲皮苷的回收率结果（n=6） Tab.3 Recoveries for myricitrin, avicularin and quercitrin |
分别测定不同进样体积时3个成分的峰面积，按照公式fs/i=fs/ fi=（Ws×Ai）/（Wi×As）。以杨梅苷为内参物，分别计算其对萹蓄苷、槲皮苷相对校正因子，结果见表 4。
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表 4 杨梅苷对萹蓄苷、槲皮苷相对校正因子 Tab.4 Relative correcting factors ofmyricitrin to quercitrin and avicularin |
采用一测多评法计算除未检出（S6、S11）的2批样品外的74批萹蓄药材中萹蓄苷和槲皮苷的含量，并对一测多评法与外标法（external standard method，ESM）的结果进行比较（见表 5），2种方法所得的结果的相对平均偏差均在5%以内。采用夹角余弦法[16]对一测多评法与常规法测得的2组数值进行统计分析，杨梅苷、萹蓄苷和槲皮苷的夹角余弦值分别为0.999 8、0.999 9、0.999 8，2组数值在统计学上无显著性差异。综上所述，采用一测多评法测定萹蓄药材黄酮类成分的含量是可行的。
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表 5 外标法和一测多评法测定萹蓄中黄酮类成分含量的比较 Tab.5 Determination results of three components in Polygoni Avicularis Herba by QAMS and external Standard method |
试验考察Dionex Ultimate3000、Shimadzu LC-30 AD 2种超高效液相色谱系统和Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）、Thermo Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 mm，1.9 µm）、Agilent Eclipse XDB-C18（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）3种色谱柱的相对校正因子。见表 6。
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表 6 不同仪器和不同色谱柱测得相对校正因子 Tab.6 Relative correcting factors determined ondifferent columns and instruments |
在仅使用杨梅苷对照品，可通过相对保留时间及峰分离度的准确定位其他2个待测成分，结果见表 7。结果表明，各成分间相对保留值在不同仪器及色谱柱条件下波动较小。因此，在缺少对照品的时候，可利用相对内参物的保留值，结合色谱峰的分离度及UV光谱特征定位目标峰的位置。
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表 7 不同仪器和不同色谱柱下目标成分的相对保留值 Tab.7 Relative retention value of analytes determinedon different instruments and columns |
本试验以全国各地所产76批萹蓄药材为研究样本，通过方法学验证、方法的耐用性试验、系统适用性和准确性考察，对一测多评法的技术适用性和实际应用可行性进行了探讨研究。结果表明，采用一测多评法计算出的含量和ESM测得的含量没有显著性差异，提示本研究建立的校正因子可靠，能够实现在萹蓄苷、槲皮苷等对照品缺乏的情况下，通过杨梅苷与萹蓄苷、槲皮苷之间相对保留时间进行色谱峰定性，利用杨梅苷和校正因子计算萹蓄苷、槲皮苷的含量。
3.2 检测波长的选择《中华人民共和国药典》2015年版一部萹蓄含量测定项下规定杨梅苷的测定波长为360 nm。采用DAD检测器进行光谱扫描，杨梅苷、萹蓄苷、槲皮苷对照品在360 nm波长处均有最大吸收，故选择360 nm作为测定波长。
3.3 标准由于《中华人民共和国药典》2015年版一部“萹蓄”药材含量测定项下，供试品溶液制备较为简单，流动相对所含的大量成分洗脱能力有限，在试验过程中发现，供试品溶液连续进样5次后，柱效急剧下降，无法再进行连续测定。针对标准中存在的问题，本课题组探索并建立了采用UPLC色谱仪，以乙腈-0.5%磷酸溶液为流动相，线性梯度洗脱法测定萹蓄中杨梅苷、萹蓄苷及槲皮苷含量的方法，经方法学验证，本方法重现性好，准确度满足要求，可以连续测定多批样本，较原标准方法优越，建议据此修订原标准方法，以利于标准的执行。
3.4 样品本次试验所用萹蓄药材样本均系野外实地采集所得，地理生态信息明确，分布范围较广。样品来源以山西、湖南、安徽所产的野生药材为主，虽然未完全涵盖全国所有省市，但从全国地域划分来说，东北、西北、华中、华南、华东、华北、西南各区域均有样本来源。从萹蓄原植物生态环境、地域分布及种群差异等方面考虑分析[17-18]，可以认为此次采集的样本基本上可以反映全国各地萹蓄药材的原始质量状态。因此本试验研究建立的一测多评法含量测定方法可以作为萹蓄药材国家标准制修订的重要参考依据。
3.5 建议《中华人民共和国药典》2015年版一部萹蓄含量测定项下规定“按干燥品计算，含杨梅苷不得少于0.030%。”本课题组采用统计学分析手段，计算出萹蓄中杨梅苷、萹蓄苷及槲皮苷的含量限度值分别为0.076%、0.043%及0.030%。基于本研究结果，建议《中华人民共和国药典》2015年版一部上调杨梅苷的含量限度，并采用多指标控制萹蓄的质量。萹蓄药材建议按干燥品计算，杨梅苷的含量不得低于0.070%，萹蓄苷的含量不得低于0.040%，槲皮苷的含量不得低于0.030%。
致谢: 本文所有萹蓄药材均由中国中医科学院中药资源中心提供，在此对袁媛老师、王凌老师和赵玉洋老师给予的指导和帮助深表感谢！
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