2019, Vol. 39 
2. 河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室, 南阳 473004
2. Henan Key Laboratory of Zhang Zhong-jing Formulae and Herbs for Immunoregulation, Nanyang 473004, China
颠茄草（Belladonnae Herba）为茄科颠茄属植物颠茄Atropa belladonna L.的干燥全草[1-2]，原产于欧洲，20世纪30年代引进国内，目前在浙江、山东、湖南、河南等地均有种植。颠茄草具有广泛的镇痛、解痉作用[3-4]，是提取阿托品的主要原料，又常制备成颠茄流浸膏、颠茄浸膏、颠茄酊以及颠茄片等成药制剂供临床使用，疗效确切，还广泛用于镇痛药的生产。
目前颠茄草的研究多集中于制剂方面[5-6]，化学成分研究较少，缺乏可靠的质量标记物，从而无法建立完善的质控标准。《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2015年版一部含量测定项下仅采用酸碱滴定法测定颠茄草总生物碱含量作为质控标准，操作烦琐，准确度低，专属性差，不能精确可靠地控制颠茄草的质量。
采用传统方法研究颠茄草化学成分，需要先制备大量提取物进行分离纯化，再将得到的纯品利用波谱技术鉴定结构。分析模式烦琐，且存在成分不稳定易被破坏、重复分离已知成分、纯品获得困难、分析周期长等问题。超高效液相色谱和质谱联用技术（UPLC-MS），结合高效液相色谱强大的分离能力与质谱技术的高灵敏度、高选择性以及准确性的特点，对于中药复杂化学成分的分析与鉴定具有较好的效果，相比于传统的中药化学分离手段具有明显的优越性[7-8]。因此，本研究采用UPLC-ESI-Q-TOF-MSE技术对颠茄草中的化学成分进行了初步分析，为快速确定其活性成分和建立质量控制方法提供依据。
1 仪器、试剂与试药颠茄草全草（采自河南省羚锐制药股份有限公司颠茄草药材种植基地），经南阳医学高等专科学校科研实验中心王宇卿教授鉴定，为茄科颠茄属植物颠茄Atropa belladonna L.的干燥全草。
Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱仪（配有在线脱气机、二元泵、自动进样器、柱温箱），Agilent公司；Agilent 6550 Q-TOF质谱仪（配有标准电喷雾离子源、Mass Hunter Data Acquisition在线工作站和Qualiative Analysis离线分析软件），Agilent公司；XS105DU型十万分之一电子天平，梅特勒-托利多公司；KQ-250DB超声波清洗机，江苏昆山超声仪器有限公司；乙腈（色谱纯），Fisher试剂公司；超纯水（Milli-Q Reference超纯水系统），Millipore公司，其余试剂均为分析纯。
对照品硫酸阿托品（批号10040-201011）、氢溴酸东莨菪碱（批号100049-201009）、东莨菪内酯（批号110768-200504），纯度均 > 98%，均购自中国食品药品检定研究院；对照品山莨菪碱（批号Y27N8C49016）、东莨菪苷（批号Y10S3S1），纯度均 > 98%，均购自上海源叶生物科技有限公司。
2 方法 2.1 溶液的制备 2.1.1 供试品溶液颠茄全草干燥、粉碎，过40目筛后得粗粉。称取粗粉1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇水25 mL，称定，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再次称量，用80%甲醇水补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22 μm微孔滤膜，4 ℃保存备用。
2.1.2 对照品溶液精密称取对照品硫酸阿托品1.3 mg、氢溴酸东莨菪碱1.4 mg、东莨菪内酯1.1 mg、山莨菪碱1.2 mg、东莨菪苷1.4 mg，分别置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解，摇匀，定容至刻度，制成单一对照品储备液。分别精密量取各单一对照品储备液1 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得混合对照品溶液。4 ℃保存备用。
2.2 测定条件色谱条件：采用Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（3 mm×150 mm，2.7 μm）；流动相为乙腈（A）-醋酸铵缓冲溶液（B）（精密称取0.096 3 g醋酸铵，加入冰乙酸20 μL，加水稀释至500 mL，即得），梯度洗脱（0~6 min，5%A→25% A；6~10 min，25%A→40% A；10~18 min，40%A→80% A；18~22 min，80%A→100% A；22~23 min，100%A→5% A）；体积流量：0.5 mL·min-1；进样量：2 μL；柱温：25 ℃。
质谱条件：采用大气压电喷雾离子源（ESI+），正离子模式扫描，样品测定前，采用调谐液校准质量轴，以保证质量精度误差小于5×10-6。参比离子m/z 121.050 9和922.009 8；质量扫描范围：m/z 100~1 500。毛细管电压4.0 kV；雾化气压力276 kPa；干燥气为N2，流量6 L·min-1；干燥气温度325 ℃；鞘气温度350 ℃，流量11 L·min-1；碎裂电压175 V；二级质谱碰撞能量20~40 eV。
2.3 样品测定取“2.1”项下供试品溶液及混合对照品溶液，按“2.2”项下条件进样分析，得到颠茄草样品溶液的总离子流图（图 1），对总离子流图中的色谱峰进行定性分析，并对离子强度≥15 000的峰进行提取，利用MS/MS功能，通过调节Q-TOF-MS的二级碎片电压，得到提取峰的二级裂解碎片信息。
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表 1 颠茄草中化合物鉴定结果 Tab.1 Identification of compounds in Belladonnae Herba by UPLC-Q-TOF/MS. |
按文献整理茄科颠茄属化合物的结构式[9-20]，采用Agilent Mass Hunter PCDL Manager软件导入并合并至Agilent TCM-PCD中药数据库中，建立颠茄属化合物数据库及谱库PCDL（personal compound database library）。采用Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis质谱分析软件对样品数据进行分子特征提取，提取各离子峰的准分子离子峰并计算可能的分子组成，然后通过PCDL数据库，在准确相对分子质量误差小于10×10-6的参数下进行自动匹配鉴定。在匹配出的化合物列表中，根据各化合物的保留时间、精确相对分子质量、二级质谱碎片信息，利用PCDL谱库信息、Agilent MSC（molecular structure correlator）结构解析软件，SciFinder、Chemspider等在线检索数据库以及对照品信息，对化合物进行筛选及结构确证。
通过分析，共鉴定出19个成分，其中13个为莨菪烷类化合物。鉴定流程见图 2。各化合物详细信息见表 1。
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图 2 化合物鉴定流程图 Fig.2 The analysis process of compounds |
颠茄草中主要含有莨菪类生物碱，根据本次质谱信息并参考文献[9-10]发现，莨菪生物碱在正离子质谱中多呈现出[M+H]+的准分子离子峰，同时在质谱解析中表现出了相似的裂解规律：（1）多有丢失中性碎片H2O（m/z 18.01）及甲基自由基CH3（m/z 15.02）的行为。（2）常发生酯键的断裂，得到莨菪酸和莨菪醇两部分碎片，常被认为是莨菪碱类化合物的特征离子。（3）C3-O键发生裂解，生成多环碎片的特征离子。（4）若C6和C7上有1个或2个含氧取代基，易有分子离子失去C6、C7及其取代基，在质谱中出现较强的M-CH2=CHOR或M-ROCH=CHOR离子。C6和C7缺乏含氧取代基的化合物及环氧化合物，则极少出现此离子。
以2号峰为例，说明化合物的鉴定过程及其裂解规律。在正离子模式下，一级全扫描质谱中其准分子离子峰为m/z 306.169 8[M+H]+，通过分子特征查找及PCDL谱库匹配，初步鉴定其分子式为C17H23NO4，可能为山莨菪碱。进一步分析其一级、二级质谱碎片，发现其主要的碎片离子m/z 262.179 6、156.101 6、149.023 0、140.107 3、121.064 7、103.054 1分别为准分子离子峰失去C6、C7及其取代基生成的[M+H-44]+碎片，酯键断裂产生的碎片，C3-O键断裂，准分子离子峰失去酰氧基所得碎片，苯乙酰基断裂及进一步失去一分子水所得碎片。其裂解途径如图 3所示，通过PCDL谱库及结构解析软件确认，并与对照品信息比对，确定化合物2为山莨菪碱，[M+H]+理论值为306.170 0，实测值与精确值之间的误差为-0.65×10-6。
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图 3 山莨菪碱的裂解方式 Fig.3 The fragmentation pattern of anisodamine |
《中国药典》2015年版中，颠茄浸膏采用渗漉提取的方法，此方法对样品量需求大，耗时长，不适宜用于UPLC分析。因此，分别以乙醇、甲醇、30%、50%、80%甲醇水溶液作为提取溶剂，考察了超声提取、加热回流、渗漉提取等提取方法，发现80%甲醇水溶液超声提取所得提取物的总离子流峰最多，峰形最好，为最佳提取方法。
4.2 流动相优化《中国药典》2015年版中，采用乙腈-磷酸盐溶液作为流动相体系对颠茄制剂进行定性及定量分析，然而，此体系不适用于质谱分析。通过不断调整，采用本文流动相梯度洗脱，可得到较多的色谱峰数目和良好的色谱峰形。
4.3 鉴定流程分析Agilent TCM-PCD中药数据库是通过集成大量中药材中已知化合物的对照品信息建立起来的，补充茄科颠茄属已知化合物的相关信息后，得到的颠茄属化合物数据库及谱库（PCDL）覆盖面更广，信息更完善，匹配出的化合物准确度高，可以快速、准确鉴定样品中所含化学成分。故采用TOF-MS得到的精确质量和同位素峰形匹配PCDL库信息来初步确定化合物的分子式，然后根据化合物的结构、裂解途径和文献数据，结合二级质谱的碎片信息，利用结构解析软件进行对比，可较准确地定性鉴定相关化学成分。对于同分异构体的区分，在有对照品的情况下，可以根据对照品的保留时间确定化合物的出峰顺序，从而进行鉴别[21]；在没有对照品的情况下，则需结合ESI-MSE技术，在碰撞池中对待定的离子进行多级裂解碰撞，获得丰富的碎片离子信息，对化合物进行结构解析，从而区分部分同分异构体，如天仙子胺N-氧化物和去氧樟柳碱。
4.4 结论综上所述，本实验采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS法，快速分析了颠茄草中19个化合物结构，并初步总结了莨菪碱类化合物的裂解规律，为颠茄草药材的质量控制及化合物研究提供了数据支撑。
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