2019, Vol. 39 
2. 长春中医药大学药学院, 长春 130000;
3. 白城市食品药品检验所, 白城 137000;
4. 呼伦贝尔北方药业有限公司, 呼伦贝尔 022150
2. College of Pharmacy, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130000, China;
3. Baicheng Institute for Food and Drug Control, Baicheng 137000, China;
4. Hulun Buir North Pharmaceutical Co. Ltd., Hulun Buir 022150, China
宁泌泰胶囊是由四季红、白茅根、连翘、大风藤、三棵针、芙蓉叶、仙鹤草7味中药组成，具有清热解毒，利湿通淋之功效[1]。宁泌泰胶囊来源于传统的苗药，苗医常常用来治疗休洼凯纳、久溜阿洼之症，用中医的说法就是湿热蕴结所致淋证，如小便不利，淋漓涩痛，尿血，以及下尿路感染、慢性前列腺炎等疾病。根据大量的临床数据报道，宁泌泰胶囊在临床上效果显著，特别针对泌尿系统疾病[2-3]。其中，广泛存在于四季红、白茅根、连翘、三棵针、仙鹤草中的没食子酸，具有显著的抗菌作用；存在于四季红、白茅根、连翘、大风藤、三棵针、仙鹤草中的盐酸小檗碱，连翘、大风藤、三棵针中的连翘酯苷A，四季红、连翘、仙鹤草中的芦丁，四季红中的槲皮素，均是其抗菌、利尿的活性成分[4-7]。而目前多以没食子酸作为宁泌泰胶囊的质量控制指标，忽视了其他活性成分的含量测定[8-10]。本文通过HPLC-DAD法同时对宁泌泰胶囊中的没食子酸、小檗碱、连翘酯苷A、芦丁和槲皮素5个活性成分进行测定，既完善了质量控制体系，又建立了简便、快捷的含量测定方法，为宁泌泰胶囊的质量标准建立提供依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪、DAD检测器（Agilent科技有限公司）；AB135-S型十万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多国际股份有限公司）；KQ-250型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率250 W，频率40 kHz）。
1.2 试药自制宁泌泰胶囊（0.38 g·粒-1，批号170501、170502、170503）；四季红、白茅根、连翘、大风藤、三棵针、芙蓉叶、仙鹤草均购于吉林省吉深药店，并由长春中医药大学中药鉴定教研室李波老师鉴别为真品。取少量仙鹤草、连翘、白茅根粉粹成细粉，过筛，混匀；剩余仙鹤草、连翘、白茅根与四季红4味加水煎煮3次，第1次2 h，第2、3次各1.5 h，合并煎液、滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15~1.21（60~70 ℃）的清膏，加入上述细粉，混匀，干燥，粉碎，装入胶囊，即得）；宁泌泰胶囊（0.38 g·粒-1，批号160501，贵阳新天药业股份有限公司）。
对照品没食子酸（批号110831-201204）、盐酸小檗碱（批号110713-201212）、连翘酯苷A（批号111810-201606）、芦丁（批号100080-201409）、槲皮素（批号10081-200406）均由中国食品药品检定研究院提供；甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司），磷酸（分析纯，北京化工厂），纯净水（杭州娃哈哈股份有限公司）。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱为Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱（0~10 min，10%A；10~20 min，10%A→33%A；20~65 min，33%A；65~70 min，33%A→40%A），流速1.0 mL·min-1，柱温25 ℃，进样量10 μL，检测波长256、280、330 nm。
2.2 溶液的配制 2.2.1 混合对照品溶液取没食子酸、小檗碱、连翘酯苷A、芦丁和槲皮素的对照品适量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得没食子酸0.070 2 mg·mL-1、盐酸小檗碱0.175 88 mg·mL-1、连翘酯苷A 0.473 7 mg·mL-1、芦丁0.253 1 mg·mL-1和槲皮素1.309 1 mg·mL-1的混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液本品内容物研细，取粉末约9 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声提取60 min，放冷，加甲醇补足减少的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 阴性样品溶液按宁泌泰胶囊处方和工艺，分别制备缺四季红、白茅根、连翘、三棵针、仙鹤草，缺四季红、白茅根、连翘、大风藤、三棵针、仙鹤草，缺连翘、大风藤、三棵针，缺四季红、连翘、仙鹤草，缺四季红的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制得没食子酸、小檗碱、连翘酯苷A、芦丁、槲皮素的阴性样品溶液。
2.3 方法学考察 2.3.1 专属性试验取上述混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件下进行测定，记录色谱图，结果见图 1。结果表明，各待测成分在相应位置均无干扰，证明该方法专属性良好，待测成分色谱峰的理论塔板数均大于3 000，分离度大于1.5。
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1.没食子酸（gallic acid，278 nm）2.小檗碱（berberine，265 nm）3.连翘酯苷A（forsythione A，330 nm）4.芦丁（rutin，330 nm）5.槲皮素（quercetin，330 nm） A.对照品（reference substances）B.样品（sample）C.阴性样品（negative sample）C1.连翘酯苷A阴性样品（negative sample without forsythione）C2.芦丁阴性样品（negaive sample without nutin）C3.槲皮素阴性样品（negative sample without quercetin） 图 1 各有效成分HPLC色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of effective components |
精密称取5个对照品适量，加甲醇制成没食子酸、小檗碱、连翘酯苷.A、芦丁和槲皮素的质量浓度分别为0.243、1.420、11.135、0.721、3.108 mg·mL-1的混合对照品储备液。分别精密吸取储备液0.2、0.4、0.8、1、2、5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成系列混合对照品溶液，在“2.1”项下色谱条件进行测定。以色谱峰面积Y为纵坐标，对照品质量浓度X为横坐标，绘制标准曲线。回归方程、线性范围、定量下限及检测下限结果见表 1。表明各成分在各自范围内线性关系良好。
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表 1 各成分线性关系 Tab.1 Linear relationships of components |
取“2.2.1”项下混合对照品溶液6份，在“2.1”项色谱条件下进行测定，测得没食子酸、小檗碱、连翘酯苷A、芦丁和槲皮素含量的RSD分别为1.4%、1.8%、1.6%、1.2%、1.1%，表明仪器精密度良好。
2.3.4 重复性试验称取本品（批号20170501）粉末适量共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件进行测定，测得没食子酸、小檗碱、连翘酯苷A、芦丁和槲皮素平均含量分别为0.020%、0.078%、0.555%、0.041%、0.161%，RSD分别为0.77%、1.3%、1.1%、1.3%、1.2%，表明方法重复性良好。
2.3.5 稳定性试验取“2.2.2”项下供试品溶液（样品批号20170501），分别于0、2、4、8、12、24 h注入高效液相色谱仪中，测得没食子酸、小檗碱、连翘酯苷A、芦丁和槲皮素色谱峰面积的RSD分别为1.1%、1.1%、1.0%、0.99%、0.53%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.3.6 加样回收率试验精密称取已知含量的宁泌泰胶囊样品（20170501）6份，每份约4.50 g。精密加入没食子酸、小檗碱、连翘酯苷A、芦丁和槲皮素质量浓度分别为0.266、1.693、13.092、0.887、3.704 mg·mL-1的混合对照品溶液2 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，计算各测定物质加样回收率。结果见表 2。
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表 2 各成分加样回收率结果（n=6） Tab.2 Recoveries of components |
取3批本品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行含量测定，结果见表 3。
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表 3 各成分含量测定结果（n=3） Tab.3 Results of content determination of components |
首先对提取溶剂进行考察，分别比较无水乙醇、甲醇、三氯甲烷、石油醚等有机试剂对样品的提取效果，最终确定以甲醇作为提取溶剂。其次，对提取方法进行考察，分别比较超声提取法、热回流提取法、索氏提取法和浸渍提取法等对样品的提取效果，最终确定以超声提取法作为提取方法。
3.2 检测波长的选择通过二极管阵列检测器，在190~400 nm之间进行全波长扫描，测得没食子酸[12]、小檗碱[11]、连翘酯苷A、芦丁和槲皮素[13]的最大吸收波长范围，以待测成分吸收大小和与其他色谱峰分离度作为考察指标，对样品中待测峰进行考察，最终确定检测波长为256 nm（小檗碱）、280 nm（没食子酸）、330 nm（连翘酯苷A、芦丁、槲皮素）。
3.3 流动相的选择以待测色谱峰的峰形和与其他色谱峰分离度作为考察指标，分别考察甲醇-水、乙腈-水，甲醇-磷酸-水，乙腈-磷酸-水，甲醇-磷酸体系，最终确定以甲醇-磷酸作为流动相体系。由于待测成分较多，极性相差较大，流动相极性跨度也较大，梯度变化不易过快，故最终确定本实验的梯度体系。
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