铁杆蒿（Artemisa sacrorum Ledeb.），蒙古名哈热-沙巴克，为菊科植物万年蒿的干燥地上部分，是现代蒙医临床上用于治疗肿瘤及相关疾病的10种主要药材之一。本品味苦，性凉，具有破痞、止痛、消肿，杀虫、收敛脓汁及黄水之功效^[1]。国内外对铁杆蒿化学成分研究报道不少，其主要含有萜类^[2-5]、有机酸类^[6]、香豆素^[7-8]和黄酮等类化合物^[9]。但目前对铁杆蒿化学成分的含量还没有一个明确的标准。

课题组在对铁杆蒿抗肿瘤活性筛选及其化学成分跟踪分离过程中发现了12个化合物，其中2个为二苯乙烯类、3个为黄酮类、4个为香豆素类、2个为苯乙酮类和1个为苯丙素类。二苯乙烯类化合物具有多种生物活性，如抗肿瘤、降压降酯、抗血小板凝集、抗菌等。白藜芦醇是典型的二苯乙烯的衍生物，在过去的数十年中，白藜芦醇作为一种广为人知的天然产物，表现出多种生物活性^[10-14]，被认为是一种植物抗毒素。现代药理研究表明^[15-16]黄酮、香豆素、苯丙素类化合物在抗炎、抗氧化和抗肿瘤等方面具有重要的作用，这一作用与铁杆蒿历代用药和民间用药功效基本一致。故课题组认为化学成分前期研究中所发现的12个化合物可能是铁杆蒿主要活性成分。本文就以分离得到的12个化合物为指标成分，采用反相高效液相色谱法同时测定不同来源铁杆蒿中这些化合物的含量变化，为综合评价铁杆蒿的质量提供了可靠依据。

1 仪器与试药

KQ-600DB型超声波冲洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AUW220D型十万之一电子天平（岛津公司）；高效液相色谱仪（LC-20AT输液泵，SPD-M20A检测器，CBM-20A工作站，CTO-22A柱温箱；岛津公司）。

对照品6-甲氧基香豆素-7-O-β-D-葡萄糖苷（S1）、6，8-二甲氧基香豆素-7-O-β-D-葡萄糖苷（S2）、铁杆蒿呋喃酮苷（S3）、2-羟基-6-甲氧基苯乙酮-4-O-β-D-葡萄糖苷（S4）、苯乙酮-4-O-β-D-葡萄糖苷（S5）、咖啡酸（S6）、5，4’-二羟基-7，3’-二甲氧基黄酮（S7）、铁杆蒿呋喃酮（S8）、7-羟基-6-甲基香豆素（S9）、5-羟基-7，4’-二甲氧基黄酮（S10）、8-羟基-6，7-二甲基香豆素（S11）、5-羟基-6，7，4’-三甲氧基黄酮（S12）均自制，纯度均高于98.5%，结构式见图 1；甲醇和乙腈为色谱纯（Fisher Scientific Inc，United States）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。铁杆蒿收集于内蒙古、新疆和青海，由内蒙古民族大学蒙医药学院蒙药生药教研室布和巴特尔教授经鉴定为菊科植物万年蒿（Artemisa sacrorum Ledeb.）的干燥地上部分，药材来源见表 1。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：Inert Sustain C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0~5 min，25%A→35%A；5~10 min，35%A→45%A；10~20 min，45%A→65%A；20~30 min，65%A→75%A）；流速：1.0 mL· min^-1；进样量20 μL；检测波长：265 nm。在上述色谱条件下，化合物S1~S12达到基线分离（R > 1.5），理论塔板数均不低于6 000，色谱图见图 2。

2.2 对照品储备液的制备

用乙醇制备化合物S1、S2和S3质量浓度分别为1.0 mg·mL^-1，S4和S8分别为0.5 mg·mL^-1，S5、S6、S7分别为2.0 mg·mL^-1，S9为0.1 mg·mL^-1，S10、S11和S12分别为0.2 mg·mL^-1的单一对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备

称取样品1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚-三氯甲烷（6:1）20 mL，超声（功率600 W，频率40 kHz）处理30 min，滤过。药渣自然晾干后，加乙醇20 mL，称定，超声处理30 min，再称定，用乙醇补足损失的量，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下制备的S1~S12单一对照品储备液0.25、0.50、0.75、1.00和1.25 mL，分别置于10 mL量瓶中，用乙醇配制成不同质量浓度的系列混合对照品溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤。在上述色谱条件下，进样20 μL进行测定，以峰面积Y作为纵坐标，化合物质量浓度X为横坐标，得回归方程，结果见表 2。

2.5 定量下限与检测下限

将化合物S1~S12的对照品储备液逐步稀释，分别以色谱图中信噪比（S/N）为10和信噪比（S/N）为3时各对照品的进样的质量浓度作为定量下限（LOQ）和检测下限（LOD），结果见表 2。

2.6 精密度试验

在上述色谱条件下，分别取同一供试品溶液（样品A5）连续进样5次，测定峰面积，分别计算化合物S1~S12的RSD，分别为1.8%、1.7%、1.4%、1.3%、1.4%、1.3%、1.2%、1.5%、1.8%、1.5%、1.5%和1.7%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

在上述色谱条件下，精密吸取同一供试品溶液20 μL，分别于0、4、6、8、12、24 h进样测定，计算化合物S1~S12的含量（mg·g^-1），其RSD分别为1.3%、1.6%、1.4%、1.3%、1.3%、1.2%、1.6%、1.8%、1.7%、1.5%、1.3%和1.8%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

取同一样品（A5）5份，按“2.3”项下制备供试品溶液，进行测定，计算化合物S1~S12的含量分别为（0.483±0.007，0.283±0.004，0.082±0.001，0.083±0.001，0.085±0.001，0.063±0.001，0.861±0.015，0.812±0.014，1.318±0.020，0.297±0.005，0.481±0.009和0.509±0.009 mg·g^-1，其RSD分别1.5%、1.3%、1.4%、1.4%、1.3%、1.6%、1.8%、1.7%、1.5%、1.7%、1.9%、和1.8%。

2.9 回收率试验

精密称取样品（A5）0.5 g，6份，精密加入化合物S1~S12适量，照“2.3”项下方法制备供试溶液，按照“2.1”项下条件测定，计算加样回收率和RSD，结果见表 3。

2.10 样品测定

精密吸取按照“2.3”项下方法制备的不同来源样品的供试品溶液各3份，每份20 μL，进样测定，按外标两点法计算样品中化合物S1~S12的含量，结果见表 4。

3 讨论

本实验比较了甲醇-水和乙腈-水的梯度洗脱系统，发现以乙腈-水（0~5 min，乙腈比例由25%→35%；5~10 min，乙腈比例由35%→45%；10~20 min，乙腈比例由45%→65%；20~30 min，乙腈比例由65%→75%）为流动相时，被测成分分离效果较好，分析时间适当，分离度符合要求。采用二极管阵列检测器对化合物S1~S12的对照品溶液进行全波长扫描，化合物S3~S5、S7、S8、S10、S12由结构中苯甲酰基引起的吸收峰约在260 nm处有最大吸收，而化合物S1、S2、S6、S9、S11在由结构中苯丙酰基引起的吸收峰约在271 nm处有最大吸收。为了检测波长接近于各化合物的最大波长，选择265 nm为检测波长。

从表 2可知，在本研究所采用的色谱条件下，所有待测化合物（S1~S12）的校准曲线在较宽的浓度范围内表现出良好的线性关系（r > 0.999 3）；从精密度、稳定性和重复性试验结果看，RSD均小于2.0%；从表 3可知，所有检测化合物（S1~S12）的平均回收率在93.3%~98.7%范围内，RSD均小于3.0%。这说明本实验所建立的HPLC具有一定的准确、稳定和可靠性。

本文应用所建立的HPLC对不同来源样品中化合物S1~S12的含量进行测定，发现铁杆蒿中被检测的12个化合物的含量随产地的不同而有显著差异，如S1在10个不同来源样品中含量变化范围在0.435~0.812 mg·g^-1，S3在0.342~0.614 mg·g^-1，S8在0.181~0.384 mg·g^-1。铁杆蒿中特征化学成分的含量变化可能与其临床功效和质量稳定有相关，故建立准确、稳定和可靠的多指标成分定量分析方法来综合评价该药质量是有必要的。

总之，本研究建立了铁杆蒿质量多指标成分评价方法，简便、快速、准确，可为评价该药材质量提供依据。