2019, Vol. 39 
2. 湖南省湘潭市食品药品检验所, 湘潭 411100
2. Hunan Xiangtan Institute for Food and Drug Control, Xiangtan 411100, China
药品生产的每一个环节都需要相对应的卫生学指标去体现药品的质量，现行生产实践中常用的灭菌方法有微波干燥灭菌、湿热灭菌、60 Co-γ射线辐照灭菌等[1]。其中60 Co-γ射线辐照灭菌是利用电离辐射来杀灭微生物的过程，具有穿透力强、灭菌效果好、灭菌速度快等特点，特别适合对挥发性组分较多的样品进行灭菌[2-3]。因此，60 Co-γ射线辐照灭菌也越来越来广泛被应用于中药产业。
小儿感冒颗粒收载于《中华人民共和国药典》2015年版，由广藿香、连翘、薄荷、大青叶等十味药材加工而成，具有疏风解表，清热解毒的功效，临床上主要用于小儿风热感冒、症见发热重、头胀痛、咳嗽痰黏、咽喉肿痛；流感见上述证候者[4]。方中广藿香、连翘为君药，广藿香为唇形科植物广藿香Pogostemoncablin(Blanco)Benth.的干燥地上部分，具有镇痛与解热、止咳化痰之功效，其主要挥发性成分多为百秋李醇、广藿香酮等小分子挥发性萜类化合物[5-6]；连翘为木犀科植物连翘orsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实，其发挥清热解毒等药理作用的主要物质基础是α-蒎烯、β-蒎烯等挥发性成分[7-8]。臣药薄荷具有疏散风热，清利头目，利咽之功能；来源于为唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的干燥地上部分，主要活性成分为薄荷脑等单萜类挥发性化合物[9-10]。本研究采用60 Co-γ射线辐照对小儿感冒颗粒进行消毒灭菌，并建立同时测定小儿感冒颗粒中5个挥发性成分α-蒎烯、β-蒎烯、薄荷脑、百秋李醇和广藿香酮的含量检测方法，分别考察2、5、8 kGy 3种辐照剂量对挥发性成分含量的影响，比较辐照前后含量变化，并确定最佳有效辐照强度条件，为小儿感冒颗粒的生产灭菌提供参考依据。
1 仪器和材料 1.1 仪器Agilent-7890 A气相色谱仪，氢火焰离子检测器(FID)(Agilent公司)；SPB-3全自动空气源(北京中惠普分析技术研究所)；PH-300氢气发生器(北京中惠普分析技术研究所)；AUW-220 D岛津电子天平(十万分之一，岛津公司)；辐照源为60 Co-γ射线辐照设备(深圳市金鹏源辐照技术有限公司)；KQ-250 DB型数控超声波清洗器(昆山超声波仪器有限公司，功率500 W)；LRH-150 B型生化培养箱(广东省医疗器械厂)；YJ-875型医用净化工作台(苏州净化设备厂)；ElectroluxBCD-211 E冰箱(伊莱克斯(中国)电器有限公司)。
1.2 材料对照品百秋李醇(批号110772-201608)、广藿香酮(批号111822-201102)、薄荷脑(批号110728-201707)均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用，使用前低温保存；α-蒎烯(批号170809，含量98%)、β-蒎烯(批号170911，含量96%)均购自上海友思生物技术公司；胰酪大豆胨琼脂培养基(批号171025)、沙氏琼脂培养基(批号170826)、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号170909)均由北京三药科技开发公司生产；氮气为高纯氮；乙酸乙酯为优级纯，其余试剂均为分析纯。小儿感冒颗粒(批号170315、170509、170713、170925、171120、180122)，规格：4克·袋-1，哈尔滨儿童制药厂有限公司生产。
1.3 统计方法以SPSS19.0软件包进行统计学处理，辐照前与辐照后两样本均数用成组t检验进行处理。
2 方法 2.1 灭菌方法将装成箱的小儿感冒颗粒，平放于专用60 Co辐照室，距60 Co辐照源60 cm左右，辐照时间24 h，选择辐照剂量分别为2、5、8 kGy。
2.2 灭菌效果检查取已辐照的小儿感冒颗粒10 g作为辐照后供试品，未经辐照的小儿感冒颗粒10 g作为辐照前对照品，分别加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，浸泡分散，充分振摇，制成1 :10的供试液，取1 :10的供试液1 mL均匀分至5个平皿(0.2 mL·皿-1)，按10倍培养基稀释法制得1 :100和1 :1 000的供试液。取制备好的供试液1 mL，置直径90 mm的无菌平皿中，注入15~20 mL温度不超过45 ℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养，除另有规定外，胰酪胨大豆琼脂培养基平板在30~35 ℃培养35 d，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20~25 ℃培养57 d，观察菌落生长情况，点计辐照前后平板上生长的所有需氧菌总数、霉菌和酵母菌菌落数。结果见表 1。从表 1可以看出，随着辐照剂量增加，小儿感冒颗粒的含菌量显著降低，可见60 Co辐照能有效除去小儿感冒颗粒中微生物。
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表 1 辐照前后含菌量测定结果 Tab.1 Results of bacteria level before and after irradiation |
分别称取α-蒎烯、β-蒎烯、薄荷脑、百秋李醇和广藿香酮对照品适量，用乙酸乙酯溶解分别制成113.75、188.39、109.68、175.85、208.62 μg·mL-1的混合对照品储备液；精密量取上述储备液5 mL，置10 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含α-蒎烯56.88 μg、β-蒎烯94.19 μg、薄荷脑54.84 μg、百秋李醇87.92 μg和广藿香酮104.31 μg的混合对照品溶液，即得，冷藏避光保存。
2.3.2 供试品溶液取装量差异项下的内容物(批号171120)，研细，取约8 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯25 mL，密塞，称定，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定，用乙酸乙酯补足减失的量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4 色谱条件[11-13]色谱柱：Agilent HP-5 MS(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；柱温采用程序升温，升温程序为初始温度50 ℃，保持5 min，以6 ℃·min-1速率升温至110 ℃，保持2 min，以10 ℃·min-1速率升温至160 ℃，保持2 min；进样口温度：220 ℃；检测器(FID)温度：250 ℃；载气为氮气，氮气流量：1.5 mL·min-1；氢气流量：40mL·min-1；空气流量：400 mL·min-1；进样方式：分流，分流比为30:1；进样量为1 μL。在上述色谱条件下，供试品和对照品出峰时间一致，各色谱峰分离较好。
2.5 方法学考察 2.5.1 线性关系分别精密吸取混合对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μL，按照“2.3”的色谱条件进行测定，记录色谱图，以峰面积(Y)为纵坐标，以对照品浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，分别绘制各组分标准曲线并进行回归计算。结果各组分线性关系良好。取混合对照品溶液，用乙酸乙酯逐步稀释，吸取1 μL进行测定，取峰面积的信噪比为10倍(S/N=10)时的对照品浓度为定量下限(LOQ)，回归方程及定量限见表 2。
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1. α-蒎烯(α-pinene) 2. β-蒎烯(β-pinene) 3.薄荷脑(menthol) 4.百秋李醇(patchoulialcohol) 5.广藿香酮(pogostone) 图 1 混合对照品(A)和供试品(B)GC图 Fig.1 GC chromatograms of mixed reference substances(A)and sample(B) |
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表 2 峰面积与浓度的线性关系和定量下限 Tab.2 Linear relation and LOQ between peak area and concentration |
取“2.3.1”项下的混合对照品溶液，按“2.4”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，以峰面积计，α-蒎烯、β-蒎烯、薄荷脑、百秋李醇和广藿香酮的RSD(n=6)分别为0.90%、1.0%、1.1%、0.80%及0.90%，说明仪器精密度良好。
2.5.3 重复性试验取同一批小儿感冒颗粒(批号171120)，按“2.3.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行分析，记录色谱图。以含量计，α-蒎烯、β-蒎烯、薄荷脑、百秋李醇和广藿香酮分别为0.368 5、0.700 4、0.302 3、0.556 9和0.681 2 mg·g-1，5个挥发性成分含量的RSD(n=6)分别为0.90%、1.0%、0.80%、1.1%和1.0%，表明重复性良好。
2.5.4 稳定性试验取同一批供试品溶液(批号171120)，分别于0、4、8、12、16、20、24 h吸取供试液1 μL注入气相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，结果α-蒎烯、β-蒎烯、薄荷脑、百秋李醇和广藿香酮峰面积的RSD(n=7)分别为0.80%、1.0%、0.90%、0.90%和1.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.5.5 加样回收率试验取同一批小儿感冒颗粒(批号171120)6份，每份约4 g，精密称定，分别精密加入α-蒎烯对照品0.272 8 mg·mL-1、β-蒎烯对照品0.513 8 mg·mL-1、薄荷脑对照品0.222 9 mg·mL-1、百秋李醇对照品0.401 1 mg·mL-1和广藿香酮对照品0.505 9 mg·mL-1各5.5 mL，按“2.3.2”项下方法制备供试溶液，按“2.4”项下色谱条件进行分析，记录色谱图，计算各成分回收率。α-蒎烯、β-蒎烯、薄荷脑、百秋李醇和广藿香酮的回收率在98.0%~102.8%之间，平均回收率分别为101.8%、100.9%、99.7%、98.9%和100.5%，RSD分别为1.3%、1.1%、0.9%、1.0%和1.2%。结果见表 3。
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表 3 加样回收试验结果(n=6) Tab.3 Analytical results of recoveries |
取辐照前后小儿感冒颗粒6批(批号170315、170509、170713、170925、171120、180122)，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行分析，记录色谱图，分别计算α-蒎烯、β-蒎烯、薄荷脑、百秋李醇、广藿香酮的含量，结果见表 4。
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表 4 样品的测定结果(mg·g-1，n=6) Tab.4 The determination results of the samples |
经成组t检验，β-蒎烯、百秋李醇、广藿香酮和薄荷脑的含量辐照前后之间差异无统计学意义(p > 0.05)；α-蒎烯含量在辐照前与辐照后(2 kGy和5 kGy)也无统计学意义(p > 0.05)，但当剂量增加到8 kGy时，α-蒎烯的含量存在显著性差异(p < 0.05)。可以认为辐照前后β-蒎烯、百秋李醇、广藿香酮和薄荷脑的含量变化不大，而α-蒎烯含量变化较大。
3 结果药材中的绝大多数微生物都能被60 Co-γ射线辐照消灭，但辐照剂量的大小会影响到有效成分的含量，所以60 Co-γ射线辐照灭菌的剂量选择特别关键。
分别取6批小儿感冒颗粒(批号170315、170509、170713、170925、171120、180122)，分别以剂量0、2、5、8 kGy辐照处理后，按“2.3.2”项下制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定，分别计算α-蒎烯、β-蒎烯、薄荷脑、百秋李醇和广藿香酮的含量，并绘制含量随剂量变化折线图，结果见图 2。
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A. α-蒎烯(α-pinene) B. β-蒎烯(β-pinene) C.百秋李醇(patchoulialcohol) D.广藿香酮(pogostone) E.薄荷脑(menthol) 图 2 不同剂量60Co辐照对小儿感冒颗粒各挥发性成分含量的影响 Fig.2 Effect of volatile components in children cold granules under irradiation at different doses |
从图 2可直观看出，β-蒎烯、百秋李醇、广藿香酮和薄荷脑在辐照剂量不高于5 kGy时含量变化不大，基本上在一条直线，含量较辐照前基本变化不大，而α-蒎烯受辐照强度的影响最大，当剂量增加到5 kGy时，含量降低不明显，在8 kGy剂量处出现明显向下趋势，表示这与“2.5”项下对含量数据进行的成组t检验结果一致，为防止α-蒎烯降解过度，影响小儿感冒颗粒的质量，故建议60 Co-γ射线辐照不宜高于5 kGy。
4 讨论α-蒎烯属于双环单萜，具有碳环结构和碳碳双键，与β-蒎烯互为同分异构体，性质不稳定，在光照或加热情况下易发生氧化、加成、热解、酯化等多种反应，在C-Pd催化作用下能异构化成β-蒎烯[14-15]，见图 3。
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图 3 α-蒎烯结构(1)及转化过程(2) Fig.3 Structures of α-pinene(1)and process of conversion(2) |
柱温是气相色谱分离的重要参数，比较120、140、160、180等恒温和多种程序升温方法，为了使5个挥发性成分在色谱柱中完全分离并满足系统适应性要求，结果以初始温度50 ℃，保持5 min，以6 ℃·min-1升温至110 ℃，保持2 min，再以10 ℃·min-1升温至160 ℃，保持2 min。
分别考察了环己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯作为提取溶剂，分别采用回流法、超声法、浸泡过夜法提取样品，结果表明，采用乙酸乙酯作为溶剂、超声提取30 min效果良好，可将待测组分提取完全且操作简便。
分别选择了DB-WAX(30 m×0.32 mm，0.25 μm)、HP-5 MS(30 m×0.32 mm，0.25 μm)及DB-1301(30 m×0.32 mm，0.25 μm)等3种不同极性的气相色谱柱，对小儿感冒颗粒中5种挥发性成分进行分析考察。结果发现，采用HP-5 MS毛细管柱时，各待测组分分离度较好且分析时间缩短。
本实验通过考察60 Co-γ射线辐照对小儿感冒颗粒中5种挥发性成分含量的影响，发现辐照剂量控制在5 kGy时，能有效对小儿感冒颗粒消毒灭菌，同时不影响制剂质量，可为今后该类药物采用60 Co-γ射线辐照灭菌提供参考。
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