2019, Vol. 39 
表1(Table 1)
2. 西安交通大学, 西安 710049
2. Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710049, China
ICH规定标准物质的定值方法为质量平衡法，其含量=（1-杂质%）×（1-水分%-挥发性物质%-灰分%-成盐离子%）×100%，即分别测定活性成分中的杂质、水分、残留溶剂、无机杂质（灰分）的含量，加上活性成分的含量，其和应为100%[1-3]。通常在标准物质研制中会综合运用HPLC法、TLC法、DSC法等测定候选原料的纯度，采用HPLC外标法、容量法、UV外标法、离子色谱法等测定候选原料的含量。但是随着标准物质研究的不断深入，我们发现，由于候选原料与其杂质的紫外响应不一定相同，无法找到可溯源的外标对照品，法定标准的液相色谱方法无法检出某些杂质等问题，使质量平衡法的结果遇到了挑战，因此，需要找到一种不受上述因素干扰的新的含量测定方法，用于佐证质量平衡法的赋值结果。
核磁共振（NMR）波谱是一种基于特定原子核在外磁场中吸收了与其分裂能级间能量差相对应的射频场能量而产生共振现象的分析方法。核磁共振定量（qNMR）分析以结构分析为基础，在进行定量分析之前，首先对化合物的分子结构进行鉴定，再利用分子特定基团的质子数与相应谱峰之间的关系进行定量测定[4]。HPLC紫外法则是假设所有的色谱峰面积和为100%的前提下计算的相对纯度，核磁信号的响应因子与氢质子数量成比例，而与分子种类无关，因此从原理上讲核磁的应用范围更广[5]。目前，国内外已有将qNMR技术应用于标准物质标化研究的报道[6-10]，Malz等[11]对核磁定量法进行了详细的方法学研究，并总结了各参数设置的常规值，Pauli等[12]对核磁定量法的校准、与其他定量方法的关系、软件使用等均进行了详细的综述。本研究运用qNMR技术，对多个化学标准物质的候选原料进行定性、定量检测分析，对该方法的应用于情况进行了深入的研究与总结，为将该方法应用于对照品的赋值佐证提供了科学依据。
1 材料与方法本研究所使用的对照品候选原料均购自于企业或科研单位：4-对二硝苯（东京化成工业株式会社，含量99.0%）；对苯二酚（ACROS，含量99.5%）；马来酸（ACROS，含量99.5%）。氘代甲醇、氘代氯仿、氘代二甲亚砜（DMSO）、氘代重水均为Sigma试剂，北京金欧翔科贸有限公司分装。
采用Ascend-500型与Advance-400型核磁共振波谱仪（Bruker公司）；MSA6.6S百万分之一电子天平（Sartorius公司）。
2 方法 2.1 供试品溶液的制备精密称取适量样品与内标化合物，加适量氘代溶剂溶解，使样品与内标的浓度约为0.05 mmol·mL-1，每个品种配制6份样品。
2.2 核磁参数设置采用zg30脉冲序列在恒温25 ℃获取1H-NMR。具体实验参数如下：谱宽（SWH）10 kHz，横向弛豫时间（D1，15~30 s），采样次数：16，空扫次数：2，采用TOPSPIN2.3实验控制及数据处理软件，必要时调节相位，采用手动积分样品与内标的峰面积。
2.3 qNMR结果计算按照《中华人民共和国药典》四部附录0441[4]与文献[3]中相对定量公式与绝对定量公式计算结果。
3 结果与分析 3.1 qNMR技术在首批对照品（无溯源对照品）含量测定的应用首批对照品通常需要采用多手段对赋值结果进行验证，如二乙酰氨乙酸乙二胺只收载于国家药品标准中，其他各国药典未收载，无法找到可溯源对照品。此外，随着药品质量控制研究的不断深入，越来越多的杂质对照品被制定到质量标准中，但这些杂质并无相应独立的质量标准，通常会采用主成分的有关物质测定方法测定杂质对照品中的“杂质”。由于杂质原料的合成路线也许与主成分的不同，其紫外响应、残留溶剂情况甚至引湿性等情况均与主成分亦可能有较大差异，因此这些杂质对照品中的“杂质”研究与检测成为了研究难点。本文根据化合物的结构与溶解特性采用不同的内标和溶剂，建立了qNMR法测定这些杂质对照品的绝对含量（表 1）。
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表 1 对照品核磁定量测定结果 Tab.1 The qNMR results of reference substances |
双甲酚磺酸铵为聚甲酚磺醛外标杂质，其纯度较高，但水分高达11.46%，质量平衡法赋值结果为88.2%，建立核磁定量法测定其绝对含量为87.61%，两者基本一致，佐证了质量平衡法结果。对氯苯乙酰胺为对乙酰氨基酚杂质，质量平衡法结果为99.96%，分别采用上批对照品（100850-201102）与USP对照品（批号R00310，含量99%）对候选原料进行HPLC法含量测定，按干燥品计算含量分别为100.58%与116.40%，差异较大，因此建立核磁定量方法测定其绝对含量为99.68%，分析原因时在USP对照品qNMR谱中发现了明显的未知峰（图 1、2），而在其HPLC色谱图中未发现明显杂质峰，推测由于USP对照品中有杂质存在，且在HPLC方法中未被准确检出，影响了HPLC法含量测定结果的准确性。
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1. 内标对硝基苯（p-nitrophenyl isocyanate，internal standard）2.样品（sample）3.未知（unknown） A.候选原料（candidate reference materials）B. USP对照品（USP reference materials） 图 1 对氯苯乙酰胺的图谱 Fig.1 The qNMR spectrums of p-chloroacetanilide |
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A.对氯苯乙酰胺[N-（4-chlorophenyl）acetamide，cas：539-03-7）].苯甲酸利扎曲普坦[rizatriptam benzoate，cas：145202-66-0）]C.尼莫地平杂质Ⅰ（nimodipine impurity Ⅰ） 图 2 对照品化学结构图 Fig.2 The chemical structures of reference substances |
在一张核磁谱图上不仅可以得到主成分的结构信息，当其他成分（如异构体，多组分化合物）或杂质（如残留溶剂）与主成分无干扰的时候，还可以看到上述化合物的信息，目前已有文献总结了核磁谱中常用残留溶剂的化学位移[13]，因此较容易从核磁图谱上分析出残留溶剂的峰。如在尼莫地平杂质Ⅰ的核磁谱上可以看到一组明显的杂质峰，经与文献[14]及无残留溶剂干扰的尼莫地平杂质Ⅰ的图谱进行比较，确认为残留溶剂甲苯峰，采用相对含量的计算公式，得出甲苯的相对含量为12.6%，与气相色谱法的测定结果（12.5%）基本一致（图 3）。此外，在氢溴酸东莨菪碱对照品qNMR谱中鉴定并准确测定了残留溶剂乙醇的含量[15]等。
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1.甲苯中的苯环上氢峰（benzene ring hydrogen peak in toluene）2.甲苯中的-CH3峰（-CH3 peak in toluene） 图 3 尼莫地平杂质Ⅰ的1H-NMR谱 Fig.3 1H-NMR spectrum of nimodipine impurity Ⅰ |
对于成盐对照品，在核磁谱上，有些盐与主成分的信号峰能够被区分，在计算时根据所选的盐基或碱基的定量峰，采用相应的分子量则可分别计算出盐基和碱基的含量。如候选原料苯甲酸利扎曲普坦分子式为C15H19N5·C6H5COOH，在其1H-NMR谱中可见苯甲酸信号与利扎曲普坦信号（见图 4、表 1），因此建立了核磁定量法在一张图谱上同时测定了苯甲酸与利扎曲普坦的绝对含量，并计算出苯甲酸与利扎普曲坦含量比为0.45，与理论值一致。但盐酸盐等含有活泼氢，通常不作为定量峰，因此在不能确定成盐是否完全的情况下，只能计算此类化合物的碱基的含量，成盐情况则最好通过离子色谱法测定。
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1.苯甲酸的氢信号（H signal in benzoic acid）2.内标氢信号（H signal in internal standard）3.利扎曲普坦的氢信号（H signal in rizatriptan） 图 4 苯甲酸利扎曲普坦的1H-NMR图谱 Fig.4 1H-NMR spectrum of rizatriptan benzoate |
有一些化学对照品本身存在2种异构体（如克罗米通等）或者是2个组分（如茶苯海明），目前药典收载的含量测定方法基本为HPLC法，采用2个组分峰面积总和来计算含量，但2个组分的紫外响应可能不同，因此在标化时建立了核磁定量法分别测定克罗米通中2种异构体的含量[16]以及茶苯海明[17]中茶碱与苯海拉明的含量。
4 讨论从qNMR法的计算公式可以发现，其结果主要与称样量和信号峰积分面积相关，当信号峰信噪比大于100时，结果不确定度为1%，信噪比越大，准确度越高[18]，因此获得一张准确的图谱是非常重要的。随着仪器精密度的不断提高，可以通过参数优化保证结果的准确性，如需要注意脉冲次数、纵向弛豫时间（T1）、图谱处理、相位校正等参数以获得准确的积分[19]。本文在建立qNMR方法时对上述因素进行了考察，如通过匀场、测定样品的T1值，选取其5倍的D1值（15~30 s），以保证每次采样间共振信号强度的一致性，满足测量精度的要求，增加扫描次数以减少仪器的干扰，对获得的图谱进行相位矫正，尽量选取多个定量峰进行积分，分别计算结果并比较差异，以减少手动积分带来的误差。
化学对照品的纯度较高（通常≥95%），当其杂质可被所采用的HPLC方法检出，并且与主成分紫外响应因子相差不大的情况下，质量平衡法结果较为准确；相应的，由于化学对照品多数为小分子化合物，结构简单，杂质含量低，对主成分氢信号干扰少，亦较容易建立核磁定量法，其结果准确度高。当2个结果不一致的时候，由于核磁定量法具有测定绝对含量与定性的优势，则更有参考意义。随着分析技术的不断进步与对照品标化工作研究的不断深入，判断对照品候选原料的质量也并非是只看HPLC纯度那么简单，若其背后隐藏的杂质未被完全检出，就存在质量标准无法控制其杂质纯度，成盐不一定完全等风险。核磁共振技术的引入，由于其具有测定绝对定量与定性的特点，为质量平衡法赋值提供了有力的佐证。
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