2019, Vol. 39 
枸杞子为茄科植物宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）的干燥成熟果实，是一种传统食药同源物品，《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）记载其具有滋补肝肾，益精明目等功效，现代药理学研究亦进一步表明其具有抗氧化、消炎等多种功效[1-2]，因而被广泛应用于医药、食疗、养生、保健等领域。由于枸杞子中含糖较多，易吸潮、发霉和虫蛀，且其色质不稳定，因此药农传统习用硫磺熏蒸的产地粗加工方法，以保证其在保留较多水分的同时，实现防虫、防腐并延长保质期，保持枸杞外观。自2013年12月1日起，我国正式实施了中药材及饮片中二氧化硫（SO2）残留限量标准，目前《中国药典》2015年版已推出了酸碱滴定法、离子色谱法、气相色谱法，分别作为第一法、第二法、第三法测定经硫磺薰蒸处理过的药材或饮片中SO2的残留量，文献亦有报道采用ICP-MS测定中药材中总硫含量和离子迁移谱测定中药材中SO2的新方法[3-4]，但这些方法不同程度存在着操作时间长，仪器装置复杂等问题，因此，发展一种能够快速、简便检测枸杞子中SO2残留量的方法势在必行。拉曼光谱法是一种无损、经济、快捷的分子光谱指纹鉴定方法，2015年版《中国药典》第四部新增了拉曼光谱法，主要用于药材真假辨别的初步鉴定，尤其是中药材的快检[5-6]。表面增强拉曼光谱技术是一种灵敏的光谱分析技术，可以在定性识别分子结构信息的同时进行物质的含量分析[7-8]；结合薄膜微萃取样品前处理技术可以有效分离和富集目标分析物[9-10]，提高表面增强拉曼光谱检测技术的抗干扰能力与检测灵敏度。本实验室已发展了顶空薄膜微萃取-表面增强拉曼光谱法快速检测葡萄酒中SO2的含量[11]，所合成的海胆状氧化锌（ZnO）萃取材料适用于选择性地富集SO2。本文通过考察影响顶空萃取效率的因素，包括酸的种类、浓度、萃取时间、相比以及萃取温度等，发展一种适用于枸杞子中SO2残留量的快速检测方法。
1 仪器与试剂 1.1 仪器Inspector Raman便携式拉曼光谱仪（DeltaNu公司，型号Inspector-300）；Labnet Spectrafuge Mini迷你离心机（C1301-230V）；MK200-1型干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司）；Millipore纯水机（18.2 MΩ·cm）；RCT基本型磁力搅拌加热装置（IKA公司）；Sartotius BS 110电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。
1.2 试剂六水合硝酸锌（Zn（NO3）2·6H2O）购自西陇化工股份有限公司。亚硫酸钠（Na2SO3，97%）、氢氧化钾（KOH）、硫酸（H2SO4，98%）等购自国药集团化学试剂北京有限公司。实验用水均为Millipore纯水器制备的超纯水。金纳米溶胶购于普识纳米科技有限公司，浓度约为0.3 mmol·L-1，平均粒径为55 nm，需浓缩后再使用。
实验前，新鲜配制Na2SO3标准溶液：称取Na2SO3固体0.100 g，用少量超纯水溶解后定容于10 mL量瓶，配制得到10 g·L-1的Na2SO3标准储备溶液，并用超纯水逐级稀释至5.00、2.50、1.25、0.62、0.31 g·L-1。
1.3 ZnO萃取基底的制备称取氢氧化钾3.36 g和六水合硝酸锌2.22 g，分别置于2个150 mL烧杯中，再分别加入超纯水15 mL溶解，得到一定浓度的氢氧化钾溶液和硝酸锌溶液。用磁力搅拌器不断搅拌氢氧化钾溶液（600 r·min-1），再通过控制分液漏斗的活塞，控制硝酸锌溶液滴入过量的氢氧化钾溶液的速度（约2~3滴·s-1），滴加过程中尽量使混合溶液保持澄清状态。待硝酸锌溶液滴加完毕后，将经超纯水润洗过的玻璃片（0.8 cm×0.8 cm）置于硝酸锌-氢氧化钾混合溶液底部，一段时间后溶液逐渐变为白色浑浊液，ZnO逐渐自然沉降在玻璃片上层。室温（25 ℃）静置12 h后取出覆有ZnO的玻璃片，再用超纯水洗涤ZnO玻璃片3次后烘干备用。
1.4 自制顶空薄膜微萃取装置一种用于与表面增强拉曼光谱分析技术联用的顶空薄膜微萃取装置如图 1所示，包括萃取支架和玻璃瓶身，萃取支架的上端固定于瓶盖的密封垫圈，下端为用于安放薄膜萃取片的U型平台。
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图 1 自制顶空薄膜微萃取装置 Fig.1 Home-made apparatus for headspace thin-film microextraction |
称取1.0 g搅碎的枸杞子样品于顶空瓶，加入体积比（V酸:V水，下同）为1:5的H2SO4溶液2 mL进行酸化，放置ZnO片于萃取支架的U型平台，并盖紧瓶盖。将该装置放置于55 ℃金属槽中恒温萃取10 min。
2.2 金纳米溶胶（金胶）的浓缩使用前将1.5 mL金纳米溶液原液离心（4 000 r·min-1）15 min，弃去上清液，浓缩后的体积为30 μL，适用于每份样品的3个平行样分析。
2.3 拉曼光谱仪检测过程将顶空萃取后的ZnO片置于载玻片上，滴加浓缩的金胶10 μL，使金胶均匀附着在ZnO片上，再将载玻片置于便携式拉曼光谱仪的支架上进行分析测定。实验过程中，每个样品各3份，每份样品的拉曼信号采集3~4次（任意选金胶覆盖的不同位点进行3~4次测定），再将所有测得的654 cm-1拉曼特征峰的峰高取平均值得到该样品定量所需的拉曼信号强度。激光波长为785 nm，激光功率选择High，积分时间设置1 s，激光光斑直径约3 mm2。
2.4 顶空薄膜微萃取-表面增强拉曼光谱法检测枸杞子中的SO2残留量在1.0 g不含亚硫酸盐的枸杞子空白样品中（采用建立的方法及《中国药典》标准方法均未检出含有SO2的样品）分别加入0、0.31、0.62、1.25、2.50、5.00、10.00 g·L-1的Na2SO3标准溶液80 µL，并使枸杞子中亚硫酸盐最后的加标质量浓度为0、25、50、100、200、400、800 mg·kg-1（每个加标浓度平行3次），静置20 min后再加入体积比为1:5的H2SO4溶液2 mL，于55 ℃萃取10 min。萃取过程结束后，取出ZnO萃取片，滴加浓缩金胶10 µL进行检测，所测得的表面增强拉曼光谱图如图 2所示。虽然枸杞子生物样品较为复杂，但由于实验条件是在55 ℃进行顶空萃取，因此仅有挥发性较强的化合物能从复杂的基底进入顶空，极大地降低了拉曼光谱图的本底背景。其次，ZnO是两性氧化物，对酸性的SO2分子具有较好的吸附作用，因此采用顶空薄膜微萃取-表面增强拉曼光谱法能够选择性地检测到SO2的存在。其中归属于O-S-O键的对称弯曲振动引起的654 cm-1处的特征峰高随着亚硫酸盐浓度的增大而明显地线性增高。在加标浓度100 mg·kg-1以上的试样中，还可以在970 cm-1处观察到S-O对称伸缩振动引起的特征峰[12]。该方法在25~800 mg·kg-1范围可以获得比较好的线性关系，检测下限为15 mg·kg-1。检测下限的计算采用公式3 s/K，其中s为对20个空白的枸杞子样品进行顶空薄膜微萃取-表面增强拉曼光谱法分析所获得的654 cm-1处特征峰高的标准偏差，K为工作曲线的斜率。
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A.拉曼光谱图（Raman spectrum） B.工作曲线图（working curve） 图 2 顶空薄膜微萃取-表面增强拉曼光谱法检测枸杞子中加标的SO2 Fig.2 Detection of the added amount of sulfur dioxide in Lycii fructus by the method combined headspace thin-film microextraction with surface-enhanced Raman spectroscopy |
取新鲜配制、质量浓度为500 mg·L-1 的Na2SO3溶液2 mL于10 mL顶空瓶，加入体积比为1:5的H2SO4溶液0.2 mL进行酸化，将ZnO片置于萃取支架的U型平台，并拧紧瓶盖。再将顶空瓶置于55 ℃恒温金属浴中萃取10 min，取出ZnO片后置于载玻片上，滴加浓缩的金胶10 μL后，分别在1、2、3、4、5、10、20、30、60、120 min进行测定，每个测量时间点于ZnO片不同位点随机测定3~4次。平行3次试验。
顶空薄膜微萃取-表面增强拉曼光谱法的稳定性与待测物的物理化学性质、金胶的稳定性和操作者的实践经验等因素相关。对于具有还原性的亚硫酸盐待测物而言，顶空薄膜微萃取后应尽快测定，而受到金胶稳定性的影响，在金胶均匀附着在ZnO片后的相对固定时间点进行表面增强拉曼光谱测量为宜。实验结果表明，加金胶后1、2、3、4、5、10 min获得的6个测量平均值具有较好的稳定性，RSD为4.7%；而20、30、60、120 min的测量值比前10 min平均测量值分别降低10%、69%、84%和81%，且随测量时间增长，每个时间点9~12个测量值的RSD也随之增大。
2.6 精密度试验在稳定性试验的基础上，固定焦距和ZnO片，滴加金胶后连续扫描测定20次，RSD为10.9%，顶空薄膜微萃取-表面增强拉曼光谱法表现出较好的精密度。
2.7 重复性试验取枸杞子样品1.0 g，平行操作6份，加体积比为1:5的H2SO4溶液2 mL酸化后，分别进行顶空薄膜微萃取-表面增强拉曼光谱分析，测得亚硫酸盐的含量为621.9 mg·kg-1，RSD为4.3%，试验的重复性较好，可以满足检测要求。
2.8 加标回收试验为了评估方法的可靠性，分别在3 d用该方法测试了枸杞子中加入低、中、高3个不同浓度Na2SO3的回收试验，如表 1所示，加标回收率在83.7%~107.3%，RSD可以控制在15%以内。在1.0 g枸杞子样品中分别加入1.25、5.00、10.00 g·L-1的Na2SO3标准溶液80 µL并使枸杞子中亚硫酸盐最后的加标质量浓度为100、400、800 mg·kg-1。
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表 1 加标回收试验结果 Tab.1 Results of recovery test |
采用顶空薄膜微萃取-表面增强拉曼光谱法测定8个枸杞子样品，并将检测结果与《中国药典》酸碱滴定法的测量结果进行比较，如表 2所示。SO2残留量较高的3个枸杞子样品分别为1 207.6、87.7和621.9 mg·kg-1，采用顶空薄膜微萃取-表面增强拉曼光谱法测得的实验结果与酸碱滴定法的测量结果接近，t检验的计算值分别为0.960、0.000和0.132，小于t值表中相应的数值（当置信水平α为0.05，自由度为7时，t为2.365），因此，2种分析方法的测定结果不存在显著性差异。由于顶空薄膜微萃取-表面增强拉曼光谱法测定SO2残留量的检测下限为15 mg·kg-1，因此对于低SO2残留量的样品未能检出，但该方法已满足《中国药典》对中药材及饮片中SO2残留量的限量检测要求。
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表 2 顶空薄膜微萃取-表面增强拉曼光谱法检测枸杞子中的二氧化硫残留量 Tab.2 Analysis of residual sulfur dioxide in Lycii fructus by the method combined headspace thin-film microextraction with surface-enhanced Raman spectroscopy |
在萃取时间10 min、萃取温度为55 ℃、顶空瓶相比（V液相:V气相，下同）为1:4的条件下，分别采用体积比为1:5的H2SO4溶液、HNO3溶液及HCl溶液酸化枸杞子样品，顶空薄膜微萃取后加金胶并测定其表面增强拉曼光谱，以波峰与波谷之间的高度绘制654 cm-1处谱峰强度，如图 3-A所示。由于ZnO纳米材料表面呈弱碱性，因此HCl和HNO3等挥发性酸在萃取过程中同样会吸附于ZnO表面，从而对SO2的吸附萃取产生竞争作用，因此以其作为酸化用酸时，SO2特征拉曼峰的强度明显减弱；另外，HNO3是具有较强氧化性的无机酸，使用过程中易将亚硫酸盐氧化为硫酸盐，降低样品中亚硫酸盐的浓度，因此所得SO2特征拉曼峰的强度明显减弱；H2SO4溶液既不具有挥发性，也不具有氧化性，因此采用H2SO4溶液酸化枸杞子样品，顶空薄膜微萃取SO2的效率最高。
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A.酸的种类（types of acids） B. H2SO4的体积比（volume ratio of sulphuric acid） 图 3 酸对顶空薄膜微萃取枸杞子中SO2效率的影响 Fig.3 The effect of acid using headspace microextraction for sulfur dioxide in Lycii fructus |
H2SO4溶液的浓度同样会影响SO2的萃取效率。在萃取温度55 ℃条件下，SO2在水中的溶解度约为3.8 g·（100 mL）-1，已知亚硫酸的pKa1为1.82，pKa2为7.00，则饱和SO2水溶液的pH约为1.0。为使SO2充分地从复杂的介质中挥发出来，需考虑加入过量的酸。为了考察酸的浓度对萃取效率的影响，实验比较了在萃取时间10 min、萃取温度55 ℃、顶空瓶相比为1:4的实验条件下，分别采用体积比为2:5、1:5、1:10、1:100和1:1 000的H2SO4溶液酸化枸杞子样品，顶空薄膜微萃取后加金胶并测定其表面增强拉曼光谱。不同酸化条件下所获得的654 cm-1处特征谱峰强度，如图 3-B所示。在体积比为1:100条件下，体系的pH约为0.45，虽然体系的酸度已经超过饱和SO2水溶液的pH值，但萃取效果并不理想。继续增大体系的酸度，顶空萃取SO2的效率显著提高。采用体积比为2:5、1:5和1:10的H2SO4溶液时，654 cm-1处的谱峰强度接近，萃取效率是采用体积比1:100和1:1 000的H2SO4溶液酸化时萃取效率的3~4倍。
3.2 萃取时间、相比对枸杞子样品中SO2萃取效率的影响在顶空薄膜微萃取技术中，目标分析物的萃取时间包括其从复杂的样品基质进入顶空的时间、从顶空进入薄膜的时间以及在薄膜中扩散的时间。虽然在非平衡态和平衡态下目标分析物都可以进行定量分析，但萃取时间直接影响方法的灵敏度以及快检的时间。在萃取温度为55 ℃、顶空瓶相比为1:4、体积比为1:5的H2SO4溶液酸化条件下，分别顶空薄膜微萃取1、5、10、15及20 min后加浓缩的金胶并测定其表面增强拉曼光谱。不同萃取时间所获得的654 cm-1处特征谱峰强度，如图 4-A所示。随着萃取时间的增加，ZnO薄膜中SO2的吸附量随之增大，10 min后趋于平衡，因此可以选择萃取时间10 min。
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图 4 萃取时间（A）和相比（B）对顶空薄膜微萃取枸杞子中SO2效率的影响 Fig.4 The effect of extraction time(A) and phase ratio(B) using headspace microextraction for sulfur dioxide in Lycii fructus |
在顶空薄膜微萃取技术中，液相与气相的相比也是影响萃取效率的1个重要因素。当液相占比过小时，由于气相中的目标分析物浓度过低，从气相进入薄膜的目标分析物数量较少，萃取效率不高；同样体积的顶空瓶中，若液相占比过大时，将导致气相压强增大，减小目标分析物的挥发。在萃取温度为55 ℃、萃取时间为10 min、体积比为1:5的H2SO4溶液酸化等实验条件下，分别在顶空瓶相比为1:4、1:3、1:2及1:1条件下进行实验，不同相比条件下所获得的654 cm-1处特征谱峰强度，如图 4-B所示。相比为1:4时，654 cm-1处的谱峰强度显著高过相比分别为1:3、1:2及1:1时的测定值，因此，对于顶空萃取枸杞子实验而言，需有足够的酸液浸没固体样品，且需有足够的顶空体积促进SO2从液相挥发到气相。基于顶空薄膜微萃取技术的特性，少量的枸杞子样品即可满足实验所需。
3.3 萃取温度对枸杞子样品中SO2萃取效率的影响在顶空薄膜微萃取技术中，萃取温度会极大地影响目标分析物的萃取效率。升高萃取温度可以使SO2更快更多地从介质中挥发到顶空中，提高萃取效率。但由于SO2从顶空进入到萃取介质薄膜是个放热反应，过高的温度将减小SO2的萃取效率，因此方法的建立需考察萃取温度对萃取效率的影响。在萃取时间为10 min、顶空瓶相比为1:4、体积比为1:5的H2SO4溶液酸化枸杞子样品的条件下，分别在萃取温度为35、45、55、65及75 ℃条件下进行实验。不同萃取温度条件下所获得的654 cm-1处特征谱峰强度，如图 5所示。当萃取温度小于55 ℃时，升高温度有利于更多的SO2从介质中挥发到密闭的顶空中；而当萃取温度超过55 ℃后，随着温度的升高，SO2从顶空进入薄膜越来越困难。因此，对于挥发性的SO2来说，55 ℃是较为合适的萃取温度。
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图 5 萃取温度对顶空薄膜微萃取枸杞子中SO2效率的影响 Fig.5 The Effect of extraction temperature using headspace microextraction for sulfur dioxide in Lycii fructus |
表面增强拉曼光谱技术是一种灵敏的光谱分析技术，可以在定性识别分子结构信息的同时进行物质的含量分析，结合薄膜微萃取样品前处理技术可有效分离和富集分析物，提高SERS检测技术的抗干扰能力与检测灵敏度。本研究发展了顶空薄膜微萃取技术-表面增强拉曼光谱法快速检测枸杞子中的SO2含量，该方法具有简单、高效、灵敏等特点，线性范围在25~800 mg·kg-1，检测下限为15 mg·kg-1，适用于中药材中SO2残留量的快速分析。
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