龟甲药用始载于汉代《神农本草经》^[1]，列为上品。《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2015年版规定龟甲为龟科动物乌龟Chinemys reevesii（Gray）的背甲及腹甲；其味咸、甘，性微寒，归肝、肾、心经，具有滋阴潜阳，益肾强骨，固经止血，补心安神等功能；多分布于山东、安徽、陕西、湖北、四川、云南、广东、广西、海南等湖泊水域地^[2]。龟甲经水煎煮，加黄酒等辅料浓缩制成的胶剂即为龟甲胶。有文献报道^[3]龟甲胶中砷、铅、铬、镉、铜、汞6种金属及有害元素的含量，但目前还未见龟甲及龟甲胶中金属及有害元素含量测定分析的全面报道。本文采用简便、准确、灵敏度高的ICP-MS法和FAAS法测定了23批龟甲及15批龟甲胶中25种元素的含量；基于25种元素的含量进一步分析元素之间的相关性；依据《中国药典》、联合国粮农组织（Food and Agriculture Oganization，FAO）和世界卫生组织（WHO）下的食品添加剂联合专家委员会（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA）中药材标准等金属及有害元素限量标准，对龟甲及龟甲胶中砷、铅、铬、铜、汞5种金属及有害元素进行初步风险评估，探讨龟甲及龟甲胶中金属及有害元素的安全性，为制订龟甲及龟甲胶质量标准提供依据。

1 仪器及试药

Scientific X Series2 ICP-MS仪（Thermo Fisher公司），AAnaiyst 800原子吸收分光光度计（Perkin Elmer公司），Multiwave型微波消解仪（Anton Paar公司），Millipore Mill-Q超纯水机（Millipor公司）。硝酸、30%过氧化氢溶液均为超纯级，超纯水自制。内标单元素标准溶液：锗（Ge，批号GSB04-1723）、铟（Y，批号GSB04-1731）、铋（Bi，批号GSB04-1719）均购自中国计量科学研究院，质量浓度为100 mg·L^-1。铅（Pb）、镉（Cd）、砷（As）、汞（Hg）、铜（Cu）、铝（Al）、铬（Cr）、锰（Mn）、钯（Pd）、钡（Ba）、钨（W）、镍（Ni）、钼（Mo）、硒（Se）、镝（Dy）、铊（Tl）、银（Ag）、锡（Sn）、铍（Be）、锑（Sb）、锶（Sr）、钙（Ca）、锌（Zn）、镁（Mg）、铁（Fe）、金（Au）26种单元素标准溶液，除Dy和Mg质量浓度为100 mg·L^-1外，其余质量浓度均为1 000 mg·L^-1，均购自国家钢铁材料测试中心。

23批龟甲样品均由湖北省药品监督检验研究院肖凌副主任药师鉴定为龟科动物乌龟Chinemys reevesii（Gray）的背甲及腹甲。15批龟甲胶来源为生产企业收集样品。

2 方法与结果 2.1 试验条件 2.1.1 微波消解条件

设置功率模式消解程序，第一阶段10 min升至1 100 W，保持10 min；第二阶段15 min升至1 400 W，保持20 min。

2.1.2 ICP-MS条件

射频功率1 200 W，雾化气流速1.04 L·min^-1，辅助气流速1.3 L·min^-1，等离子体气流速15 L·min^-1，蠕动泵转速20.0 r·min^-1，重复次数为3次，扫描次数为10次。

2.1.3 FAAS法条件

Zn、Mg、Fe、Sr、Ca的波长分别为213.8、279.6、248.3、460.7、422.7 nm；Zn、Mg、Fe、Ca的灯电流为5.0 mA，Sr的为3.0 mA；光谱通带均为0.2 nm。

2.2 溶液制备 2.2.1 标准储备工作溶液

分别精密量取单元素标准溶液适量，用5%硝酸溶液稀释制成每1 mL分别含Pb、As、Pd、W、Cr、Mn、Ni 5 μg，含Al、Ba、Cu、Zn、Mg、Ca 50 μg，含Cd、Mo、Se 2.5 μg，含Hg、Dy、Tl、Ag、Sn、Be、Sb、Sr 0.5 μg，含Fe 1.5 μg的溶液，即得。

2.2.2 标准工作溶液

精密量取上述标准储备工作溶液适量，用5%硝酸溶液稀释制成每1 mL含Pb、As、Pd、W、Cr、Mn、Ni均分别为0、1、5、10、20、50 ng，含Al、Ba、Cu、Zn、Mg、Ca均分别为0、10、50、100、200、500 ng，含Cd、Mo、Se均分别为0、0.5、2.5、5、10、25 ng，含Hg、Dy、Tl、Ag、Sn、Be、Sb、Sr均分别为0、0.1、0.5、1、2、5 ng，含Fe分别为0、40、60、80、100、120 ng的混合溶液，即得。

2.2.3 内标溶液

精密量取Ge、Y、Bi内标单元素标准溶液适量，用水稀释制成1 μg·mL^-1的混合溶液，即得。

2.2.4 供试品溶液

称取中药材龟甲粉末（过50目筛）样品0.1 g（龟甲胶0.25 g），精密称定，置于高压消解罐中，加入过氧化氢溶液2 mL和硝酸5 mL，放置12 h，旋紧罐盖，按照微波消解仪的标准操作步骤进行消解。冷却后取出，缓慢打开罐盖排气，将高压消解罐放入控温电热板上，于135 ℃赶酸。消解罐取出放冷，将消化液转移至50 mL量瓶中，用10 mL水分次洗涤消解罐，洗液合并于量瓶中，加入Au单元素标准工作溶液（用5%硝酸稀释制成1 mg·L^-1的溶液）200 μL，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；除不加样品及Au单元素标准溶液外，其余同法制备试剂空白溶液。用ICP-MS法测定Pb、Cd、As、Hg、Cu、Al、Cr、Mn、Pd、Ba、W、Ni、Mo、Se、Dy、Tl、Ag、Sn、Be、Sb共20种元素含量；用FAAS法测定Sr、Ca、Zn、Fe、Mg元素含量。

2.3 线性关系考察及检测下限测定

将上述25种元素标准工作溶液依法测定，绘制标准曲线，求得回归方程及相关系数（r），取11次试剂空白溶液测定值计算标准偏差s，本方法检测下限L = 3s/f（其中f为标准曲线斜率），结果见表 1。

2.4 加样回收率试验

称取已测知含量的1号龟甲样品4份，每份0.1 g，分别加入Pb、As、Pd、W、Cr、Mn、Ni 250 ng，Cd、Mo、Se 125 ng，Sb、Sn、Dy、Tl、Be、Ag、Hg 25 ng，Al、Ba、Cu 2 500 ng，Sr 50 μg，Ca 0.01 g，Mg 0.4 mg，Zn 0.01 mg，Fe 20 μg，依法制成50 mL的供试品溶液，进样测定。元素回收率测定结果均在74.6%~116.2%，RSD在0.81%~9.50%，表明该方法回收率良好。

2.5 样品含量测定

取23批龟甲及15批龟甲胶，按“2.2.4”项下方法制备供试溶液，按“2.1”项下条件对样品中的25种元素含量进行测定，结果见表 2、3。

其中Cd、Be、Ag、Hg、Ti、Dy、Pd、Se在龟甲中未检出，龟甲胶中的金属元素及有害元素含量较龟甲大幅降低，其中Ca元素含量降幅达5个数量级，Se、Pb、Ag、Hg元素含量稍有增加，结果见图 1。

3 讨论 3.1 常量金属元素

5种常量元素在龟甲中含量从大到小依次为Ca、Mg、Sr、Fe、Zn，在龟甲胶中含量从大到小依次为Ca、Mg、Zn、Fe、Sr。龟甲和龟甲胶中5种常量元素平均含量分别为194.5 g·kg^-1和0.45 g·kg^-1；Sr元素在龟甲胶中有明显减少，在龟甲和龟甲胶中的平均含量分别为0.48 g·kg^-1和6.83 mg·kg^-1；龟甲和龟甲胶中Mg元素平均含量分别为3.8 g·kg^-1和0.34 g·kg^-1，Zn元素平均含量分别为0.13 g·kg^-1和0.34 g·kg^-1，Fe元素平均含量分别为0.17 g·kg^-1和0.036 g·kg^-1。龟甲的主要成分为碳酸钙及磷酸钙，Ca元素含量占龟甲量近20%；Sr是人体必需的微量元素之一，Sr与骨生成关系较为密切，体内外研究均表明Sr具有促进成骨细胞生长和抑制破骨细胞形成的双重功效^[4-6]。Ca和Sr元素在龟甲中含量较高，与文献报道^[7]吻合。Mg元素几乎参与人体的所有新陈代谢过程，Fe和Zn元素作为人体必需的微量元素，对人的生长发育有着重要作用。在龟甲和龟甲胶中，上述5种常量元素可能与滋阴潜阳，健骨功效有一定联系，其相关性有待进一步研究。

3.2 部分微量金属元素

Cd是农业环境中最危险的重金属元素之一，被WHO确定为优先研究的食品污染物。江晨洁等^[8]对全国6省市甲壳类水产品中Pb和Cd污染情况调查与分析发现，被检样品中Pb和Cd的检出率均为100%。而在所测龟甲及龟甲胶样品中均未测出Cd含量，这有利于龟甲的进一步开发利用。

W元素经胃肠吸收量极微，W盐含量相等于2%时，经胃肠吸收的量足以引起死亡^[9]。龟甲中W元素含量均≤0.1 mg·kg^-1，龟甲胶中W元素含量均 < 0.061 mg·kg^-1。W元素在龟甲及龟甲胶中较为安全。

Al元素与人体健康有着密切关系，摄入过量的Al元素，将影响中枢神经系统，增加老年痴呆症的发生几率，我国每日允许摄入Al的量为60 mg·d^-1[10]。龟甲中Al的含量范围为5.0~205.0 mg·kg^-1，龟甲胶中Al的含量范围为0~9.39 mg·kg^-1，按服用量，龟甲及龟甲胶中Al相对安全。

Ni元素是人体必需元素，Ni具有许多独特的生理功能，缺少Ni也会引起各种疾病，如糖尿病、贫血、肝硬化、尿毒症、肾衰和肝脂质及磷脂质代谢异常等^[11]。Ni的含量范围为3.2~6.9 mg·kg^-1，龟甲胶中Al为0~0.546 mg·kg^-1。人体对Ni的日需要量约为0.3 mg^[12]，按服用量，龟甲及龟甲胶能适当为机体提供Ni元素，Ni相对安全。

Mn元素摄入量国家科学院确定成年男女分别为2.3 mg·d^-1和1.8 mg·d^-1，日常饮食是摄入Mn的主要来源^[13]。Mn的含量范围，龟甲为2.1~24.8 mg·kg^-1，龟甲胶为未检出~0.406 mg·kg^-1，按服用量，龟甲及龟甲胶中Mn相对安全。

3.3 龟甲中各元素相关性分析

Cd、Be、Ag、Hg、Ti、Dy、Pd、Se这8种元素在龟甲中未检出，进行其他17种元素相关性分析（SPSS 21.0），结果见表 4。结果表明，Pb与Ni、As之间，Ni与Cu、Ba、Sb之间，Cr与Mn之间，Mn与Ba、Sn之间存在显著正相关（P < 0.01）。有研究^[14]表明，Cr能提高周围组织对葡萄糖的利用，Mn²⁺可作为柠檬酸脱氢酶的辅助因子，参与糖的有氧氧化，两者具有协同作用。Zn与Ni、Cu、Sr之间，Sn与Ca之间存在显著负相关（P < 0.05），说明龟甲中这些元素在被吸收时可能相互抑制；其中，Zn元素的含量会影响Cu的吸收，研究表明金属硫蛋白对Cu具有更高的亲和力，Zn含量增加时，可以通过金属硫蛋白抑制Cu的吸收^[14]。生物体内金属元素之间，金属元素与成分之间会形成各种形态或配位化合物，通过协同或拮抗作用改变药物的生理活性^[15]。深入研究元素、成分之间的相关性，将有助于揭示中药材治病机理。

3.4 龟甲及龟甲胶风险评估

JECFA发布《食品添加剂和污染物评估报告》中设定，每千克体质量每周可耐受摄入量（PTWI） = 7 d×每日可接受摄入量（ADI），每千克体质量每月可耐受摄入量（PTMI） = 30 d×ADI。2010年Cd的PTMI设定为25 μg·kg^-1[16]；Pb的PTWI为25 μg·kg^-1，As的PTWI为15 μg·kg^-1，无机Hg的PTWI为4 μg·kg^-1[17]；JECFA推荐人群Cu的暂定每日最大耐受摄入量（PMTDI）为0.05~0.5 mg·kg^-1，本文采用0.5 mg·kg^-1[18]。

以每日由膳食补充剂中摄取的金属及有害元素的量不大于日总暴露量的10%折算最大残留限量L（mg·kg^-1），L = W×C×10%/F，其中F为中药材（饮片）的最大日摄入量（kg）；C为ADI（mg·kg^-1）；W为某个体的体质量（60 kg）。

参照欧洲食品安全局（EFSA）于2009年推出的累积风险评估工作范例^[19]中的评价方式，依据JECFA的规定，按成人龟甲最大服用量0.024 kg·d^-1（《中国药典》2015年版一部规定龟甲的服用量为9~24 g·d^-1）换算最大限量（表 5）。进一步通过比较最大残留限量与样品实际测定值来评估23批龟甲样品。样品10、19的As超限，超限率为8.7%；样品8、10的Pb超限，超限率为8.7%。龟甲中As、Pb存在一定风险。同理，对龟甲胶进行评估，公式仍为L = W×C×10%/F，但F为龟甲胶最大服用量0.009 kg·d^-1，比较最大残留限量值与样品实际测定值来评估值评估15批龟甲胶样品。结果见表 5。

结果显示，龟甲胶中Pb、As、Hg、Cd、Cu的实际测定值均远小于最大残留限量，可认为龟甲胶中金属及有害元素的风险较小。