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  药物分析杂志   2019, Vol. 39 Issue (5): 846-851.  DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.05.11
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李婧, 刘文静. GC-MS测定莪术中β-榄香烯的血药浓度及大鼠体内药代动力学研究[J]. 药物分析杂志, 2019, 39(5): 846-851. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.05.11.
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LI Jing, LIU Wen-jing. Determination of plasma concentration of β-elemene in Curcuma zedoaria by GC-MS and its pharmacokinetic study in rats[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2019, 39(5): 846-851. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.05.11.
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西南民族大学中央高校基本科研业务费专项资金项目(No.2019NQN56)

第一作者

李婧, Tel:13550163485;E-mail:27918716@qq.com

文章历史

收稿日期:2018-01-28
GC-MS测定莪术中β-榄香烯的血药浓度及大鼠体内药代动力学研究
李婧 , 刘文静     
西南民族大学药学院, 成都 610041
摘要目的:建立快速灵敏的气质联用(GC-MS)法测定莪术中β-榄香烯在大鼠血浆中血药浓度,并研究β-榄香烯在大鼠体内的药代动力学特征。方法:血浆样品的处理采用正己烷液-液萃取方法,萘为内标。色谱柱:DB-5毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);程序升温:初始60℃,保持1 min,再以30℃·min-1的速度升温至160℃,保持3 min,再以10℃·min-1的速度升温至200℃,保持2 min。采用电子轰击离子源及选择离子扫描模式(SIM);选择监测离子:β-榄香烯m/z 93,内标m/z 128。按β-榄香烯10 mg·kg-1灌胃给药后,测定大鼠血浆中β-榄香烯的浓度,并用DAS 2.0软件计算药代动力学参数。结果:血浆中β-榄香烯质量浓度在0.05~200.0 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好(r2 = 0.999 1),定量下限为0.05 μg·mL-1;低、中、高3个浓度准确度、日内及日间精密度均小于5%;提取回收率分别为91.7%、105.1%、108.8%;低、中、高3个浓度血浆样品在室温放置12 h,4℃冰箱中放置24 h及反复冻融4次后均能保持稳定。大鼠灌胃莪术提取液后β-榄香烯药-时曲线符合二室模型;主要药代学参数:AUC(0-t为(9.83±1.07)μg·L-1·h,t1/2α为(0.47±0.05)h,t1/2β为(1.82±3.11)h,Tmax为(2.06±0.37)h,Cmax为(2.61±0.17)μg·mL-1结论:该方法简便、准确,专属性强,适用于莪术中β-榄香烯在大鼠体内的药代动力学研究。
关键词莪术    β-榄香烯    液-液萃取    挥发油    大鼠血浆    血药浓度    药代动力学    气相色谱质谱联用    
Determination of plasma concentration of β-elemene in Curcuma zedoaria by GC-MS and its pharmacokinetic study in rats
LI Jing, LIU Wen-jing    
College of Pharmacy, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China
Abstract: Objective: To establish a rapid, sensitive method for the determination of plasma concentration of β-elemene in Curcuma zedoaria using capillary gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) and to study the pharmacokinetics in rats.Methods: The plasma sample was treated with a liquid-liquid extraction method of n-hexane, and naphthalene was used as an internal standard (IS).The determination was performed on DB-5 column (30 m×0.25 mm, 0.25 μm).The initial column temperature was 60℃, maintained for 1 min, then raised to 160℃ at a rate of 30℃·min-1, maintained for 3 min, and finally increased to 200℃ at a rate of 10℃·min-1 and maintained for 3 min.EI and single ion monitoring pattern (SIM) were used for ion scanning with m/z 93 (β-elemene) and m/z 128 (IS).After administration of β-elemene 10 mg·kg-1 by oral gavage, the concentration of β-elemene in rat plasma was determined, and the pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 software.Results: There was excellent linearity of the plasma concentration of β-elemene in the range of 0.05-200.0 μg·mL-1 (r2 = 0.999 1), and the lowest limit of quantification was 0.05 μg·mL-1.The accuracy, intra-day and inter-day precisions of low, medium and high concentrations were less than 5% and the recovery rates were 91.7%, 105.1% and 108.8%, respectively.The plasma samples of low, medium and high concentrations were kept at room temperature for 12 h, and were stable after being placed in refrigerator at 4℃ for 34 h and repeatedly frozen and thawed for 4 times.The concentration-time curve of β-elemene of the extract of rats after administration of Curcuma zedoaria by oral gavage was consistent with the two-compartment model.The main pharmacokinetic parameters were as follows:AUC(0-t) was (9.83±1.07) μg·L-1·h, t1/2α was (0.47±0.05) h, t1/2β wss (1.82±3.11) h, Tmax was (2.06±0.37) h, and Cmax was (2.61±0.17) μg·mL-1.Conclusion: The established method is simple, accurate, specific and suitable for pharmacokinetic studies of β-elemene in curcuma zedoaria in rats.
Keywords: Curcuma zedoaria    β-elemene    liquid-liquid extraction    essential oil    rat plasma    drug plasma concentration    pharmacokinetics    GC/MS    

中药莪术(Curcuma zedoaria)是姜科植物蓬莪术、广西莪术和温郁金的干燥根茎,具有行气破血、消积止痛之功效[1]。莪术根茎主要含姜黄素类、挥发油以及多糖类、酚酸类、甾醇类、生物碱类等成分,挥发油主要含莪术醇、β-榄香烯、莪术二酮、异莪术烯醇等[2],这些成分通过调节多种关键信号通路,发挥抗炎,抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡等作用[3-7]。β-榄香烯能诱导细胞周期停滞,抑制细胞增殖;诱导caspases-3、7、9的活性,抑制bc1-2的表达,使细胞色素C释放,诱导肿瘤细胞凋亡;还可以抑制HCT-8、KB、K562和EJ细胞增殖,并且对分子靶向类抗癌药物具有协同增效作用[8-12]。β-榄香烯作为莪术的主要药效成分之一,具有较好的开发前景,β-榄香烯注射液在大鼠及人体内药代动力学的测定方法已有报道[13-14],莪术药材中β-榄香烯的提取及测定方法也有报道[15],而对于莪术药材中β-榄香烯的药代动力学研究少见报道。莪术药材中成分较为复杂,需建立高效的提取方法以及灵敏的测定方法,本文采用液-液萃取法进行提取并采用气质联用(GC-MS)法,测定莪术药材中β-榄香烯在大鼠血浆中的血药浓度,进行了大鼠体内药代动力学研究,为莪术药材的新药研发及临床研究提供方法及数据参考。

1 仪器与试药 1.1 仪器

GC 6890-5973MSD气质联用仪(安捷伦公司),G1701DA MSD Chemstation工作站;BS224S万分之一电子天平(赛多利斯公司);TGL-16B台式高速离心沉淀器(上海安亭科学仪器厂);XW-80型旋涡混合器(上海医科大学实验仪器厂);MTN-2800D型氮吹仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);高纯氮气(纯度≥ 99.5%)。

1.2 试药

对照品β-榄香烯(批号100268-200401)和萘(批号111673-200803),中国食品药品检定研究院;莪术药材(四川新荷花中药饮片股份有限公司),经西南民族大学吕露阳副教授鉴定为姜科植物蓬莪术;甲醇、正己烷为色谱纯,Fisher公司;水为双蒸水;其余试剂均为分析纯。清洁及SD大鼠(雌雄各半,体质量(250±20)g,四川大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(川)-2013-026。

2 方法与结果 2.1 血药浓度测定 2.1.1 色谱条件

色谱柱:安捷伦DB-5毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μ m);载气:高纯度氦气(> 99.5%);流速:1.0 mL·min-1;进样口温度:260 ℃;进样量:1 μ L;分流比:1:2;程序升温(初始60 ℃,保持1 min;以30 ℃·min-1的速度升温至160 ℃,保持3 min;再以10 ℃·min-1的速度升温至200 ℃,保持2 min)。

2.1.2 质谱条件

电离方式:EI;扫描方式:单离子监测(SIM)模式,正离子方式检测;电子轰击能量:70 eV;离子源温度:210 ℃;四极杆温度:100 ℃;选择监测离子:β-榄香烯m/z 93,萘m/z 128(内标)。

2.1.3 莪术挥发油的制备

取莪术饮片干燥粉末(过40目筛)100 g,精密称定,置1 L挥发油提取器中,加500 mL水回流提取5 h,以吐温-80收集挥发油至100 mL,置于4 ℃冰箱保存,备用。以GC法测得β-榄香烯含量为6.21%。

2.1.4 对照品溶液的配制

精密称取β-榄香烯对照品100 mg,置10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,得到β-榄香烯对照品储备液(10.0 mg·mL-1),置于4 ℃冰箱中保存,备用。精密称取内标物萘对照品100 mg,置10 mL量瓶中,加正己烷稀释至刻度,摇匀,得到内标储备液(10.0 mg·mL-1),置于4 ℃冰箱中保存,备用;临用前用正己烷稀释配制成浓度为100 μ g·mL-1的内标溶液。

2.1.5 血浆样品的预处理

取空白血浆100 μ L,置于1.5 mL洁净EP管,加入内标溶液(100 μ g·mL-1)20 μ L,涡旋混匀1 min,加入正己烷200 μ L沉淀蛋白,涡旋振荡5 min,于4 ℃以6 000 r·min-1高速离心10 min,取上清液置于洁净的EP管中,进样1 μ L。

2.2 方法学考察 2.2.1 专属性

分别取6个不同批次的大鼠空白血浆、大鼠给药后血浆及空白血浆,加入一定量的β-榄香烯和内标,按“2.1”项下溶液配制及血浆处理方法进行处理,采用“2.1”项下色谱与质谱条件测定。β-榄香烯和内标的保留时间分别约为10.58和11.31 min,两者分离良好,内源性物质无干扰,该方法专属性良好。β-榄香烯和内标的质谱图见图 1,典型色谱图见图 2

图 1 β-榄香烯(A)和内标(B)全扫描质谱图 Fig.1 Full scan mass spectra of β-elemene (A) and internal standard (B)

1.内标(internal standard)  2. β-榄香烯(β-elemene)
A.空白血浆(blank plasma)  B.空白血浆+β-榄香烯+内标(blank plasma+β-elemene+internal standard)  C.大鼠灌胃2 h后的血浆样品+内标(plasma samples + internal standard of rats 2 h after oral gavage)
图 2 典型色谱图 Fig.2 Typical chromatograms
2.2.2 线性范围和检测灵敏度

取β-榄香烯对照品储备液适量,用甲醇稀释成7个不同浓度对照品溶液;取空白血浆100 μ L,分别加入上述不同浓度的对照品溶液,配制成相当于β-榄香烯质量浓度分别为0.05、0.2、1、5、10、50、200 μ g·mL-1的系列标准血浆样品,按“2.1.5”项下方法处理,进样分析。以β-榄香烯与内标峰面积比值(Y)为纵坐标,浓度(X)为横坐标,在0.05~200.0 μ g·mL-1浓度范围内,两者呈良好的线性关系,线性方程为

$ Y = 0.043\ 32X-0.000\ 396\ \ \ \ {{r}^{2}} = 0.999\ 1(n = 7) $

定量下限为0.05 μ g·mL-1

2.2.3 准确度及精密度试验

取空白血浆100 μ L,加对照品溶液分别配制β-榄香烯低、中、高3种浓度(0.2、1、5 μ g·mL-1)的标准血浆样品,每个浓度平行5份,按“2.1.5”项下方法操作,进样分析。各浓度标准血浆样品分别平行测定5次,连续测定5 d,根据当日标准曲线计算各样品中β-榄香烯的浓度,考察方法的准确度、日内精密度及日间精密度。结果低、中、高3个浓度的准确度及日内、日间精密度均小于5%,符合方法学验证要求。见表 1

表 1 精密度试验结果(x±s,n = 5) Tab.1 Results of accuracy and precision tests
2.2.4 提取回收率试验

取空白血浆100 μ L,加对照品溶液分别配制成β-榄香烯低、中、高3个浓度(0.2、1、5 μ g·mL-1)的标准血浆样品,每个浓度平行5份,按“2.1.5”项下方法操作,测定β-榄香烯(A1)和内标(A2)的峰面积,与在相同基质条件下未经萃取的β-榄香烯(B1)和内标(B2)的峰面积进行比较,计算回收率。按A1/B1×100%计算β-榄香烯低、中、高3个浓度的回收率分别为(91.7±3.8)%、(105.1±5.8)%、(108.8±1.5)%,各浓度水平回收率的RSD在1.8%~6.4%之间,满足要求。

2.2.5 基质效应

取6份不同批次的空白血浆,每个批次3份,每份100 μ L,加对照品溶液分别配制成β-榄香烯低、中、高3个浓度(0.2、1、5 μ g·mL-1)的标准血浆样品,按“2.1”项下方法处理,进样测定,记录β-榄香烯及内标峰面积,计算5个点平均血药浓度(C1)。同时,不加血浆直接用对照品溶液分别配制β-榄香烯低、中、高3个浓度(0.2、1、5 μ g·mL-1)的溶液,按“2.1.5”项下方法进行处理,进样测定,记录β-榄香烯及内标峰面积,计算5个点平均血药浓度(C2)。按基质效应 = C1/C2×100%计算得血浆中低、中、高3个浓度的基质效应分别为(92.73±4.19)%、(92.11±2.37)%和(109.01±5.08)%,RSD为1.2%~7.1%,结果显示没有基质效应。

2.2.6 稳定性考察

分别取空白血浆100 μ L,加对照品溶液分别配制成β-榄香烯低、中、高3个浓度(0.2、1、5 μ g·mL-1)的标准血浆样品,每个浓度平行5份,按“2.1.5”项下方法进行处理,进样测定,计算β-榄香烯血药浓度。考察对照品血浆分别在室温放置12 h(0、1、2、4、6、8、12 h),4 ℃冰箱中放置24 h,-20 ℃保存15 d,反复冻融4次等情况下对稳定性的影响。结果见表 2,表明在上述条件下,β-榄香烯在血浆中稳定性良好。

表 2 血浆样品中β-榄香烯的稳定性(n = 5) Tab.2 Stability of β-elemene-containing plasma samples
2.3 药代动力学研究 2.3.1 血浆样品的采集

取体重(250±20)g的SD大鼠8只,实验前适应性喂养2 d,称量,按10 mg·kg-1剂量灌胃莪术提取液,给药后分别于0、0.2、0.5、1、2、2.5、3、4、6、8、10、12和24 h眼眶采血0.5 mL,置于1.5 mL涂有肝素钠的EP管中,轻晃,使与抗凝剂混合均匀,6 000 r·min-1离心10 min,取上清液,置-20 ℃冰箱中保存备用。

2.3.2 药时曲线及药代动力学参数

按照“2.1”项下方法,测定大鼠血浆中β-榄香烯的浓度。采用DAS 2.0对血药浓度数据进行药代动力学参数拟合处理,结果显示拟合的药-时曲线符合二室模型,权重系数为1/C2。药时曲线见图 3,主要药代动力学参数见表 3

图 3 β-榄香烯大鼠灌胃给药后的平均药时曲线图 Fig.3 Mean concentration-time curve of β-elemene in rats after oral gavage

表 3 主要药代动力学参数(n = 8) Tab.3 Main pharmacokinetic parameters
3 讨论

随着天然产物的逐步开发,其作为抗癌药物的活性成分取得了较好的成果。莪术的抗癌作用已被大量研究证实,莪术中挥发性成分β-榄香烯具有较好的抗癌活性,目前已有β-榄香烯口服剂与注射剂上市,有研究[11]对β-榄香烯注射剂进行了人体药代动力学研究,发现β-榄香烯在人体内具有吸收好及消除快的特点。但目前对β-榄香烯口服剂以及莪术药材中β-榄香烯成分的药代动力学研究较少,其提取分离、预处理及仪器分析方法还有待探索,本文采用液-液萃取法提取血浆中β-榄香烯,建立GC-MS方法测定莪术药材中β-榄香烯的血药浓度,并对其提取液灌胃大鼠后的体内药代动力学情况进行了研究,为莪术及β-榄香烯的开发及临床应用提供了参考。

β-榄香烯为莪术中挥发油成分,适合采用GC检测,而药材中β-榄香烯含量较少,其血药浓度含量更低,因此采用GC-MS的方式进行检测,该方法具有较好的分离性能及较高的灵敏度,适用于对β-榄香烯血药浓度的测定。本研究使用选择离子检测(SIM)模式记录色谱图,监测待测化合物的特征离子(β-榄香烯m/z 93,萘m/z 128),在高灵敏度的前提下排除了各种潜在的干扰,同时也使分析时间大大缩短。

β-榄香烯不溶于水,只溶于有机溶剂,而血浆及药材中的多种有机物质对其测定会产生一定干扰。本研究在处理血浆样品时采用了液-液萃取法,并考察了乙醚、三氯甲烷、甲醇及异丙醇等溶剂对β-榄香烯及内标物的萃取效果,结果发现正己烷对β-榄香烯及内标物萘的萃取回收率较高,提取液中含有的内源性干扰物较少,因此采用正己烷为萃取溶剂。同时还发现,提取后如果挥干溶剂,β-榄香烯损失较大,因此采用正己烷提取,不浓缩直接进样的方法。

β-榄香烯的给药途径主要有口服及注射2种,本实验采用口服灌胃的方式对大鼠进行实验,市售β-榄香烯口服制剂的给药剂量为每次0.2 g,根据动物与人每1 kg体质量剂量折算系数,计算得到β-榄香烯的大鼠给药剂量为10 mg·kg-1。此外,预试验的结果提示,在灌胃莪术提取液后2 h左右血药浓度达到峰值,同时为了兼顾吸收、分布、消除相,拟定采血时间为给药后0、0.2、0.5、1、2、2.5、3、4、6、8、10、12及24 h,得到较完整的数据,本研究发现,莪术药材挥发油中β-榄香烯在大鼠体内达峰时间、吸收消除均较快,提示可以持续给药、缓控释制剂或者静滴方式给药,使血药浓度维持在有效范围内。

4 结论

本文建立了GC-MS测定莪术药材中β-榄香烯在大鼠体内血药浓度的方法,采用液-液萃取方法进行预处理,该方法灵敏度高,重复性好,回收率高,稳定性好,能够满足莪术药材中β-榄香烯药代动力学研究要求,为莪术及β-榄香烯的临床研究开发提供参考。

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