2019, Vol. 39 
中药莪术（Curcuma zedoaria）是姜科植物蓬莪术、广西莪术和温郁金的干燥根茎，具有行气破血、消积止痛之功效[1]。莪术根茎主要含姜黄素类、挥发油以及多糖类、酚酸类、甾醇类、生物碱类等成分，挥发油主要含莪术醇、β-榄香烯、莪术二酮、异莪术烯醇等[2]，这些成分通过调节多种关键信号通路，发挥抗炎，抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡等作用[3-7]。β-榄香烯能诱导细胞周期停滞，抑制细胞增殖；诱导caspases-3、7、9的活性，抑制bc1-2的表达，使细胞色素C释放，诱导肿瘤细胞凋亡；还可以抑制HCT-8、KB、K562和EJ细胞增殖，并且对分子靶向类抗癌药物具有协同增效作用[8-12]。β-榄香烯作为莪术的主要药效成分之一，具有较好的开发前景，β-榄香烯注射液在大鼠及人体内药代动力学的测定方法已有报道[13-14]，莪术药材中β-榄香烯的提取及测定方法也有报道[15]，而对于莪术药材中β-榄香烯的药代动力学研究少见报道。莪术药材中成分较为复杂，需建立高效的提取方法以及灵敏的测定方法，本文采用液-液萃取法进行提取并采用气质联用（GC-MS）法，测定莪术药材中β-榄香烯在大鼠血浆中的血药浓度，进行了大鼠体内药代动力学研究，为莪术药材的新药研发及临床研究提供方法及数据参考。
1 仪器与试药 1.1 仪器GC 6890-5973MSD气质联用仪（安捷伦公司），G1701DA MSD Chemstation工作站；BS224S万分之一电子天平（赛多利斯公司）；TGL-16B台式高速离心沉淀器（上海安亭科学仪器厂）；XW-80型旋涡混合器（上海医科大学实验仪器厂）；MTN-2800D型氮吹仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；高纯氮气（纯度≥ 99.5%）。
1.2 试药对照品β-榄香烯（批号100268-200401）和萘（批号111673-200803），中国食品药品检定研究院；莪术药材（四川新荷花中药饮片股份有限公司），经西南民族大学吕露阳副教授鉴定为姜科植物蓬莪术；甲醇、正己烷为色谱纯，Fisher公司；水为双蒸水；其余试剂均为分析纯。清洁及SD大鼠（雌雄各半，体质量（250±20）g，四川大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（川）-2013-026。
2 方法与结果 2.1 血药浓度测定 2.1.1 色谱条件色谱柱：安捷伦DB-5毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μ m）；载气：高纯度氦气（> 99.5%）；流速：1.0 mL·min-1；进样口温度：260 ℃；进样量：1 μ L；分流比：1:2；程序升温（初始60 ℃，保持1 min；以30 ℃·min-1的速度升温至160 ℃，保持3 min；再以10 ℃·min-1的速度升温至200 ℃，保持2 min）。
2.1.2 质谱条件电离方式：EI；扫描方式：单离子监测（SIM）模式，正离子方式检测；电子轰击能量：70 eV；离子源温度：210 ℃；四极杆温度：100 ℃；选择监测离子：β-榄香烯m/z 93，萘m/z 128（内标）。
2.1.3 莪术挥发油的制备取莪术饮片干燥粉末（过40目筛）100 g，精密称定，置1 L挥发油提取器中，加500 mL水回流提取5 h，以吐温-80收集挥发油至100 mL，置于4 ℃冰箱保存，备用。以GC法测得β-榄香烯含量为6.21%。
2.1.4 对照品溶液的配制精密称取β-榄香烯对照品100 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到β-榄香烯对照品储备液（10.0 mg·mL-1），置于4 ℃冰箱中保存，备用。精密称取内标物萘对照品100 mg，置10 mL量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，得到内标储备液（10.0 mg·mL-1），置于4 ℃冰箱中保存，备用；临用前用正己烷稀释配制成浓度为100 μ g·mL-1的内标溶液。
2.1.5 血浆样品的预处理取空白血浆100 μ L，置于1.5 mL洁净EP管，加入内标溶液（100 μ g·mL-1）20 μ L，涡旋混匀1 min，加入正己烷200 μ L沉淀蛋白，涡旋振荡5 min，于4 ℃以6 000 r·min-1高速离心10 min，取上清液置于洁净的EP管中，进样1 μ L。
2.2 方法学考察 2.2.1 专属性分别取6个不同批次的大鼠空白血浆、大鼠给药后血浆及空白血浆，加入一定量的β-榄香烯和内标，按“2.1”项下溶液配制及血浆处理方法进行处理，采用“2.1”项下色谱与质谱条件测定。β-榄香烯和内标的保留时间分别约为10.58和11.31 min，两者分离良好，内源性物质无干扰，该方法专属性良好。β-榄香烯和内标的质谱图见图 1，典型色谱图见图 2。
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图 1 β-榄香烯（A）和内标（B）全扫描质谱图 Fig.1 Full scan mass spectra of β-elemene (A) and internal standard (B) |
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1.内标（internal standard） 2. β-榄香烯（β-elemene） A.空白血浆（blank plasma） B.空白血浆+β-榄香烯+内标（blank plasma+β-elemene+internal standard） C.大鼠灌胃2 h后的血浆样品+内标（plasma samples + internal standard of rats 2 h after oral gavage） 图 2 典型色谱图 Fig.2 Typical chromatograms |
取β-榄香烯对照品储备液适量，用甲醇稀释成7个不同浓度对照品溶液；取空白血浆100 μ L，分别加入上述不同浓度的对照品溶液，配制成相当于β-榄香烯质量浓度分别为0.05、0.2、1、5、10、50、200 μ g·mL-1的系列标准血浆样品，按“2.1.5”项下方法处理，进样分析。以β-榄香烯与内标峰面积比值（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，在0.05~200.0 μ g·mL-1浓度范围内，两者呈良好的线性关系，线性方程为
| $ Y = 0.043\ 32X-0.000\ 396\ \ \ \ {{r}^{2}} = 0.999\ 1(n = 7) $ |
定量下限为0.05 μ g·mL-1。
2.2.3 准确度及精密度试验取空白血浆100 μ L，加对照品溶液分别配制β-榄香烯低、中、高3种浓度（0.2、1、5 μ g·mL-1）的标准血浆样品，每个浓度平行5份，按“2.1.5”项下方法操作，进样分析。各浓度标准血浆样品分别平行测定5次，连续测定5 d，根据当日标准曲线计算各样品中β-榄香烯的浓度，考察方法的准确度、日内精密度及日间精密度。结果低、中、高3个浓度的准确度及日内、日间精密度均小于5%，符合方法学验证要求。见表 1。
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表 1 精密度试验结果（x±s，n = 5） Tab.1 Results of accuracy and precision tests |
取空白血浆100 μ L，加对照品溶液分别配制成β-榄香烯低、中、高3个浓度（0.2、1、5 μ g·mL-1）的标准血浆样品，每个浓度平行5份，按“2.1.5”项下方法操作，测定β-榄香烯（A1）和内标（A2）的峰面积，与在相同基质条件下未经萃取的β-榄香烯（B1）和内标（B2）的峰面积进行比较，计算回收率。按A1/B1×100%计算β-榄香烯低、中、高3个浓度的回收率分别为（91.7±3.8）%、（105.1±5.8）%、（108.8±1.5）%，各浓度水平回收率的RSD在1.8%~6.4%之间，满足要求。
2.2.5 基质效应取6份不同批次的空白血浆，每个批次3份，每份100 μ L，加对照品溶液分别配制成β-榄香烯低、中、高3个浓度（0.2、1、5 μ g·mL-1）的标准血浆样品，按“2.1”项下方法处理，进样测定，记录β-榄香烯及内标峰面积，计算5个点平均血药浓度（C1）。同时，不加血浆直接用对照品溶液分别配制β-榄香烯低、中、高3个浓度（0.2、1、5 μ g·mL-1）的溶液，按“2.1.5”项下方法进行处理，进样测定，记录β-榄香烯及内标峰面积，计算5个点平均血药浓度（C2）。按基质效应 = C1/C2×100%计算得血浆中低、中、高3个浓度的基质效应分别为（92.73±4.19）%、（92.11±2.37）%和（109.01±5.08）%，RSD为1.2%~7.1%，结果显示没有基质效应。
2.2.6 稳定性考察分别取空白血浆100 μ L，加对照品溶液分别配制成β-榄香烯低、中、高3个浓度（0.2、1、5 μ g·mL-1）的标准血浆样品，每个浓度平行5份，按“2.1.5”项下方法进行处理，进样测定，计算β-榄香烯血药浓度。考察对照品血浆分别在室温放置12 h（0、1、2、4、6、8、12 h），4 ℃冰箱中放置24 h，-20 ℃保存15 d，反复冻融4次等情况下对稳定性的影响。结果见表 2，表明在上述条件下，β-榄香烯在血浆中稳定性良好。
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表 2 血浆样品中β-榄香烯的稳定性（n = 5） Tab.2 Stability of β-elemene-containing plasma samples |
取体重（250±20）g的SD大鼠8只，实验前适应性喂养2 d，称量，按10 mg·kg-1剂量灌胃莪术提取液，给药后分别于0、0.2、0.5、1、2、2.5、3、4、6、8、10、12和24 h眼眶采血0.5 mL，置于1.5 mL涂有肝素钠的EP管中，轻晃，使与抗凝剂混合均匀，6 000 r·min-1离心10 min，取上清液，置-20 ℃冰箱中保存备用。
2.3.2 药时曲线及药代动力学参数按照“2.1”项下方法，测定大鼠血浆中β-榄香烯的浓度。采用DAS 2.0对血药浓度数据进行药代动力学参数拟合处理，结果显示拟合的药-时曲线符合二室模型，权重系数为1/C2。药时曲线见图 3，主要药代动力学参数见表 3。
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图 3 β-榄香烯大鼠灌胃给药后的平均药时曲线图 Fig.3 Mean concentration-time curve of β-elemene in rats after oral gavage |
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表 3 主要药代动力学参数（n = 8） Tab.3 Main pharmacokinetic parameters |
随着天然产物的逐步开发，其作为抗癌药物的活性成分取得了较好的成果。莪术的抗癌作用已被大量研究证实，莪术中挥发性成分β-榄香烯具有较好的抗癌活性，目前已有β-榄香烯口服剂与注射剂上市，有研究[11]对β-榄香烯注射剂进行了人体药代动力学研究，发现β-榄香烯在人体内具有吸收好及消除快的特点。但目前对β-榄香烯口服剂以及莪术药材中β-榄香烯成分的药代动力学研究较少，其提取分离、预处理及仪器分析方法还有待探索，本文采用液-液萃取法提取血浆中β-榄香烯，建立GC-MS方法测定莪术药材中β-榄香烯的血药浓度，并对其提取液灌胃大鼠后的体内药代动力学情况进行了研究，为莪术及β-榄香烯的开发及临床应用提供了参考。
β-榄香烯为莪术中挥发油成分，适合采用GC检测，而药材中β-榄香烯含量较少，其血药浓度含量更低，因此采用GC-MS的方式进行检测，该方法具有较好的分离性能及较高的灵敏度，适用于对β-榄香烯血药浓度的测定。本研究使用选择离子检测（SIM）模式记录色谱图，监测待测化合物的特征离子（β-榄香烯m/z 93，萘m/z 128），在高灵敏度的前提下排除了各种潜在的干扰，同时也使分析时间大大缩短。
β-榄香烯不溶于水，只溶于有机溶剂，而血浆及药材中的多种有机物质对其测定会产生一定干扰。本研究在处理血浆样品时采用了液-液萃取法，并考察了乙醚、三氯甲烷、甲醇及异丙醇等溶剂对β-榄香烯及内标物的萃取效果，结果发现正己烷对β-榄香烯及内标物萘的萃取回收率较高，提取液中含有的内源性干扰物较少，因此采用正己烷为萃取溶剂。同时还发现，提取后如果挥干溶剂，β-榄香烯损失较大，因此采用正己烷提取，不浓缩直接进样的方法。
β-榄香烯的给药途径主要有口服及注射2种，本实验采用口服灌胃的方式对大鼠进行实验，市售β-榄香烯口服制剂的给药剂量为每次0.2 g，根据动物与人每1 kg体质量剂量折算系数，计算得到β-榄香烯的大鼠给药剂量为10 mg·kg-1。此外，预试验的结果提示，在灌胃莪术提取液后2 h左右血药浓度达到峰值，同时为了兼顾吸收、分布、消除相，拟定采血时间为给药后0、0.2、0.5、1、2、2.5、3、4、6、8、10、12及24 h，得到较完整的数据，本研究发现，莪术药材挥发油中β-榄香烯在大鼠体内达峰时间、吸收消除均较快，提示可以持续给药、缓控释制剂或者静滴方式给药，使血药浓度维持在有效范围内。
4 结论本文建立了GC-MS测定莪术药材中β-榄香烯在大鼠体内血药浓度的方法，采用液-液萃取方法进行预处理，该方法灵敏度高，重复性好，回收率高，稳定性好，能够满足莪术药材中β-榄香烯药代动力学研究要求，为莪术及β-榄香烯的临床研究开发提供参考。
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