2019, Vol. 39 
流感是由流感病毒引起的急性发热性呼吸道传染病，具有发病率高，传播迅速，多次反复等特点，并且流感临床症状较重，并发症发生率高，严重时会导致死亡，在高危人群（年老体弱、免疫力低下、慢性病患者等）中有更高的发病率和死亡率[1]。达菲（又称磷酸奥司他韦）作为一种神经氨酸抑制剂，可以在人体内转化成对流感病毒神经氨酸酶有抑制作用的活性代谢物，与流感病毒神经氨酸酶活性位点结合，从而抑制流感病毒颗粒的释放[2-3]，达到治疗流感的目的，临床常用于甲型、乙型流感病毒的治疗。
目前对于达菲的药效以及临床作用研究较多，而基于代谢组学方法研究其作用机制的报道较少。代谢组学主要通过对机体内源性小分子代谢物进行定性定量分析，研究生物体在内、外因素作用下代谢物种类和数目等变化的动态规律及其与生理、病理变化的关联性[4-5]，分析差异代谢物的作用和参与的代谢通路，从而发现药物干预病症的内在机制[6]。课题组在前期研究工作中，建立了肾阳虚外感小鼠模型[7]，模拟临床上高危人群感染流感的情况。本文拟采用代谢组学的方法，初步探讨达菲用药过程中，特别是对于肾阳虚外感证的干预过程中，对于代谢通路的调控作用，从机体代谢网络调控的角度探索达菲治疗流感的内在作用机制。
1 材料 1.1 动物与药物昆明小鼠，雄性，体质量（20±2）g，SPF级，山东鲁抗动物实验中心提供，动物许可证号为SCXK（鲁）20080002；苯甲酸雌二醇，批号140627，购自宁波第二激素厂，2 mg·mL-1；流感病毒H1N1，北京地方株，引自中国CDC病毒病研究所，参考文献[8]对H1N1病毒进行传代；达菲，购自上海罗氏制药有限公司，批号B3017。
1.2 仪器与试剂Thermo Fisher Ulti Mate 3000液相色谱系统和Thermo Fisher Q Exactive高分辨质谱仪（Thermo Fisher公司）；Mettler AE240电子天平（梅特勒公司）；VortexGenie 2涡旋振荡器（Scientific lndustries公司）；高速离心机（Thermo Fisher公司）；SIGMA低速冷冻离心机（SIGMA公司，D-37520）；BAT-12微探头温度计（Physitemp Instruments）；VMR小动物麻醉机（Midmark公司）；甲醇、乙腈、甲酸、异丙醇均为色谱纯（Thermo Fisher公司）。
2 方法 2.1 模型与给药36只昆明小鼠按照体质量及肛温分为3组，正常组、模型组和达菲组。基于课题组前期研究基础，首先复制肾阳虚模型小鼠[7]，在此基础上，鼻腔接种H1N1流感病毒，建立肾阳虚外感小鼠模型[9]。达菲组按照人的临床等效剂量9.75 mg·kg-1·d-1以10 mL·kg-1灌胃给药，正常组、模型组给予等量的生理盐水。每天1次，连续给药6 d。末次给药24 h后，通过眼球取血，制备血清存于-80 ℃，备用。
2.2 样品前处理血清放置至室温，取100 μL样品于EP管内，加入甲醇300 μL，涡旋5 min，4 ℃下12 000 r·min-1离心15 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，备用；从所有待测样品中各取10 μL混合，按照上述方法，制备成质控样本。
2.3 液质联用条件色谱条件：Halo C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流速0.3 mL·min-1；柱温45 ℃；进样室4 ℃；流动相A为0.05%甲酸-水溶液，B为0.05%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱（正离子模式：0~1 min，2%B；1~9 min，5%B→45%B；9~15 min，45%B→100%B；15~17 min，100%B；17~22 min，100%B→2%B）。质谱条件：电喷雾离子源（ESI），采用正离子扫描检测；鞘气流速45 L·min-1；辅助气流速10 L·min-1；耐热温度350 ℃；喷雾电压3.5 kV；毛细管温度300 ℃；质谱分辨率70 000 FWHM（m/z 200）；扫描方式为全扫描；质量扫描范围m/z 80~1 000[负离子模式下梯度洗脱（0~3 min，15%B；3~10 min，15%B→45%B；10~12 min，45%B→85%B；12~15 min，100%B；15~20 min，100%B→15%B）。质谱条件为喷雾电压3.0 kV；毛细管温度350 ℃；其他均与正离子模式相同]。
2.4 数据分析过分子特征提取采集的数据，经MS convert（64-bit）软件转换为通用格式（.*mzXML），然后使用R语言、MPP、SIMCA-P等软件处理数据，筛选得到VIP > 1的数据，再进行t检验和方差分析，选择满足P < 0.05且Fold change ≥2.0的化合物作为潜在生物标志物，并进行无监督的主成分分析（PCA），然后使用HMDB（人类代谢组数据库）查询生物标志物。分析得到的精确相对分子质量，结合HMDB（http://www.hmdb.ca/）、KEGG（http://www.genome.jp/keg/）、METLIN（http://www.metlin.scipps.edu）等数据库，根据各化合物的二级质谱碎片离子，对化合物进行结构鉴定，将鉴定得到的潜在生物标志物进行代谢通路的关联和网络分析。
3 结果 3.1 体质量与肛温正常组小鼠皮毛光滑，活泼好动，精神状态好，且体质量日益渐增；模型组小鼠感染病毒后体质量日趋下降，精神萎靡，与正常组小鼠有显著差异；达菲组给药干预后，对小鼠体质量无明显作用，但肛温逐渐回升，且从第4天开始具有统计学差异（见表 1）。
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表 1 肺指数、各组小鼠肛温变化 Tab.1 Lung index and changes in rectal temperature of mice in each group |
流感病毒属于上呼吸道病毒，主要引起肺部炎症，肺指数越高，表明炎症越严重。从表 1可见，模型组肺指数高于正常组（P < 0.01），说明模型组小鼠肺部有炎症；达菲组肺指数低于模型组，说明给药后肺部炎症减轻（P < 0.05）。
3.3 LC-MS总离子流图采用LC-MS采集各组小鼠血清样本数据，得到3组小鼠正、负离子模式下总离子流图（TIC），见图 1。
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a.正常组（normal group）b.模型组（model group）c.达菲组（tamiflu group） 图 1 正（A）、负（B）离子模式下总离子流图 Fig.1 Total ion chromatograms of the samples under positive(A) and negative(B)ion modes |
采集的原始数据经预处理，然后分别采用PCA和PLS-DA方法对数据进行分析，结果显示正负离子模式下各组样本在空间上已经达到完全分离。正离子模式R2X=0.588，R2Y=0.98，Q2=0.836；负离子模式R2X=0.501，R2Y=0.938，Q2=0.829，R2Y与Q2（cum）之间的差值小于0.3，并且Q2（cum）大于50%，表明模型的预测能力良好[10]，故构建的PLS-DA模型可信有效，可进一步分析。见图 2。
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■正常组（normal group）○模型组（model group）▲达菲组（tamiflu group） A.正离子模式（positive ion mode）B.负离子模式（negative ion mode） 图 2 各组小鼠血清的PLS-DA图 Fig.2 PLS-DA map of mouse serum of each group |
通过PLS-DA分析得到的VIP > 1的数据，结合t检验和ANOVA分析（P < 0.05，FC > 2.0），通过物质的精确质荷比及同位素比例，在HMDB、METLIN和KEGG数据库中搜索，结合其二级碎片信息，鉴别潜在生物标志物，具体结果见表 2和表 3。
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表 2 正离子模式下血清差异代谢物 Tab.2 Serum differential metabolites in positive ion mode |
以正离子模式下LC-MS/MS获得的离子[m/z 175.12（tR=0.69 min）]和负离子模式下LC-MS/MS获得的离子[m/z 304.23（tR=10.96 min）]为例，简要介绍潜在生物标志物的结构推导过程。正离子模式下，在m/z 174.11（tR = 0.69 min）处提取二级质谱图（图 3-A），显示分子离子峰[M+H]+为175.12，其特征碎片离子为m/z 116.07，参考文献[11]推测该化合物可能为精氨酸，结合二级质谱分析，推测该化合物裂解方式如图 4所示；负离子模式下，在m/z 304.23（tR =10.96 min）处提取二级质谱图（见图 3-B），分子离子峰[M-H]-为304.24，其特征碎片离子为m/z 259.24，参考文献[12]推测该化合物为花生四烯酸，其裂解方式见图 5。
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表 3 负离子模式下血清差异代谢物 Tab.3 Serum differential metabolites in negative ion mode |
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图 3 正（A）、负（B）离子模式下提取二级质谱图 Fig.3 Extraction of secondary mass spectrum in positive(A) and negative(B)ion modes |
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图 4 正离子模式下m/z 175.12（tR=0.69 min）裂解方式 Fig.4 m/z 175.12(tR=0.69 min)cracking mode in positive ion mode |
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图 5 负离子模式下提取m/z 304.23（tR=10.96 min）裂解方式 Fig.5 m/z 304.23(tR=10.96 min)cracking mode in negative ion mode |
在课题组前期工作中，开展了达菲、《伤寒论》经方-麻黄细辛附子汤以及中成药连花清瘟胶囊对于肾阳虚外感小鼠干预作用的比较研究，结果发现，达菲药效低于麻黄细辛附子汤，但高于连花清瘟胶囊[13]。本研究基于代谢组学的方法，考察达菲对于肾阳虚外感小鼠代谢通路的干预作用。在成功复制肾阳虚外感小鼠模型的基础上，采用达菲干预，结果显示给药组小鼠肺指数、死亡率、肛温等各项指标相对于模型组均有明显改善。血清样本采用LC-MS/MS分析，数据经统计学分析筛选出22个差异性化合物，认为其为潜在的生物标志物；根据高分辨质谱数据以及二级质谱碎裂的信息，对其进行了初步的定性分析，推测主要为葡萄糖、氨基酸、甘油磷脂类、花生四烯酸等物质，与其相关的代谢通路有14条，主要涉及糖代谢、视黄醇代谢、甘油磷脂代谢等。
葡萄糖是机体生命活动所依赖的主要能源物质之一，为机体生命活动提供能量保证。模型组小鼠血清中D-葡萄糖含量显著下降，丙酮酸含量升高；达菲给药后，相对于模型组，这2种物质均出现良好的回调。推测病毒感染后模型小鼠机体葡萄糖大量消耗，丙酮酸堆积[14]，能量代谢途径出现异常。给药干预后机体能量代谢有回调趋势。
维生素A可增强机体的免疫反应，维生素A缺乏会降低机体视黄醇的转运，引起免疫应答异常，还可引起气管、支气管上皮细胞发育受阻，完整性受到破坏[15-17]。文献报道，精氨酸也参与机体的免疫调节[18]。本研究发现，模型组维生素A及精氨酸含量明显下降，经达菲给药干预后，上述2种物质含量趋于正常。故推测在达菲对肾阳虚外感小鼠干预过程中，可以干预与机体免疫功能相关的视黄醇代谢和有关的氨基酸代谢。
甘油磷脂类物质与疾病感染、免疫功能以及多种疾病的发生和发展密切相关[19]。甘油磷脂是肺泡表面活性物质的重要成分，对肺部感染炎症后进行控制，并且可以保护细胞免受氧化应激而死亡[20]；磷脂酰乙醇胺作为肺泡表面的活性物质，可被磷脂酶A2作用转化为溶血磷脂酰乙醇胺（LysoPE）[21]。本研究中，模型组甘油磷脂类化合物含量显著下降，给药干预后该类物质呈明显上升趋势，推测达菲在用药过程中，会调控与炎症相关的甘油磷脂类物质代谢通路。
本研究从代谢组学的角度，通过高分辨质谱对差异性代谢物进行了初步分析，推测了达菲干预肾阳虚外感小鼠可能的代谢通路。肾阳虚外感证潜在生物标志物的结构有待于通过对照品对照的方式进一步验证，同时本研究的发现为下一步代谢靶标的定量分析奠定基础。
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