2019, Vol. 39 
2. 珀莱雅化妆品股份有限公司, 杭州 310015
2. PROYA Cosmetics Co. Ltd, Hangzhou 310015, China
脂肪的氧化是导致各种肉类及肉加工产品品质变差的主要因素，其中，脂质和蛋白质氧化后会形成脂质氧化物、羰基蛋白配合物、亚硝基化合物等，这些物质会使肉的风味、肉色及营养价值等发生负面变化并且有可能产生有毒物质，而肉色和肉风味特性的保持都依赖于抗氧化剂机制[1]。肌肽作为一种天然水溶性的内源性二肽，广泛存在于哺乳动物机体内，其结构为β-丙氨酰-L-组氨酸，1900年，俄国学者Guelwitsh和Amiradzibi首次从李比希牛肉膏中分离获得[2]。肌肽具有多种生物活性功能，如抗氧化性、抗糖化作用、缓冲调节能力[3]，导致巨噬细胞活化等[4]，是维持机体正常状态的一种含量很低的物质[5]。肌肽在不同类型肌纤维中的含量[6]与活性[7]存在一定的差异，但主要存在于骨骼肌中，约为1.60~20.60 mmol·g-1[6]。
肌肽纯品广泛的生理学功能主要表现在2个方面：在分子水平上，具有缓冲pH、螯合金属离子、抗氧化及抑制非酶糖基化等生理活性；在细胞与组织水平上，具有恢复疲劳，延缓衰老，预防糖尿病并发症，防治动脉粥样硬化及心血管疾病等生理功能[8]。邱玉朗等[9]通过添加不同浓度的纯肌肽于肉鸡的饮用水中，试验显示中剂量组和高剂量组的总抗氧化能力显著高于对照组与低剂量组，可见肌肽提高肉鸡抗氧化能力与剂量呈正相关。田莹等[10]通过研究肌肽与维生素E单独及联合使用对育肥猪肉品质和抗氧化性能的影响，发现肌肽可显著提高育肥猪血清总抗氧化能力（T-AOC）及总超氧化物歧化酶（T-SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性（P < 0.05）。王国华等[11]通过对照试验，研究肌肽对H9N2亚型猪流感病毒致小鼠肺组织的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）的影响，结果显示肌肽可以改善肺组织的水肿，减轻小鼠肺损伤的程度，降低死亡率。因此，肌肽作为一种低毒、高效的天然抗氧化物质，其应用前景十分广阔[12]。
目前，针对肌肽的分析检测方法有柱前衍生化法[13-14]、高效毛细管电泳法[15]、微芯片毛细管电泳非接触电导检测法[16]、反相色谱法[17-22]和离子色谱法[23-25]。柱前衍生化法在衍生过程中，产生的副产物可能会影响目标峰的分离；毛细管电泳技术使用的缓冲液较为复杂；肌肽的检测主要使用反相液相色谱法和离子交换色谱法。本文分别采用这2种方法检测牛肉中的肌肽，并对检测结果进行显著性检验，为方法的选择提供参考。
1 材料与方法 1.1 仪器Agilent 1200型高效液相色谱仪配紫外检测器；赛默飞离子色谱仪5000+配金电极电化学检测器及自再生KOH淋洗液。SK 2200H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；TDZ5-WS型台式低速自动平衡离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）。
1.2 材料乙腈（色谱纯，美国天地有限公司），醋酸钠（优级纯，上海凌峰化学试剂有限公司），肌肽（取自Exsymol Monaco公司，纯度 > 98%），所有用水均为电阻率18.20 MΩ·cm-1的去离子水。实验牛肉为澳洲圆霖鲜牛肉，购自当地超市。
1.3 溶液的制备 1.3.1 对照品溶液精密称取肌肽0.10 g于100 mL量瓶中，以超纯水溶解并定容，配制成质量浓度为1 000 μg·mL-1的储备液，储存于4 ℃冰箱中备用。分别取上述储备液适量，配制成质量浓度分别为0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00、8.00 μg·mL-1的溶液，即得。
1.3.2 供试品溶液称取切成粒状的牛肉约10.00 g，加入超纯水50.00 mL，用匀浆机搅碎（损失率为8.41%），再加水30.00 mL，超声（500 W，50~60 Hz）处理20 min，将悬浊液于40 ℃水浴加热30 min，取出离心（4 000 r·min-1）30 min，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，得到的滤液稀释20倍进IEC分析，稀释10倍进RP-HPLC分析。按下式计算牛肉中肌肽的相对含量（μg·g-1）。
| $ 含量 = \left[ {\left( {\frac{{A + b}}{k}} \right) \times V} \right]/(1 - 8.41\% )m $ | (1) |
A—色谱峰面积；b—线性方程的截距；k—线性方程的斜率；V—样品前处理后的体积（mL）；m—样品质量（g）。
1.4 色谱条件 1.4.1 RP-HPLC色谱条件采用Agilent TC-C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相为乙腈-水（15：85），柱温35 ℃，流速1.00 mL·min-1，进样体积25.00 μL，检测波长210 nm。色谱图见图 1。
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图 1 Agilent TC-C18色谱柱分离肌肽对照品溶液（2.00 μg·mL-1）色谱图 Fig.1 Chromatogram of reference substance solution of carnosine(2.00 μg·mL-1)for separation by Agilent TC-C18 column |
分别采用Dionex CarboPacTM PA10（4 mm×50 mm）保护柱和Dionex CarboPacTM PA10（4 mm×250 mm）分析柱及Dionex AminoPacTM PA-10（2 mm×50 mm）保护柱和Dionex AminoPacTM PA-10（2 mm×250 mm）分析柱分离，金电极检测，直流安倍电位，检测波形分别为“Carbohydrates（Standard Quad）”和“Amino Acids（pH/Ag/AgCl Reference）”。以70%超纯水和30%醋酸钠溶液（100 mmol）为淋洗液；Dionex CarboPacTM PA10柱流速为1.00 mL·min-1；Dionex AminoPacTMPA 10柱流速为0.25 mL·min-1。进样体积均为25.00 μL。
分离色谱图见图 2。从图中可以看出，Dionex CarboPacTM PA10和Dionex AminoPacTM PA-10都能应用于肌肽的检测，但Dionex AminoPacTM PA-10峰形不如Dionex CarboPacTM PA10峰形对称，同时有基线漂移现象。
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A. Dionex CarboPacTM PA10 B. Dionex AminoPacTM PA-10 图 2 对照品溶液（2.00 μg·mL-1）色谱图 Fig.2 Chromatograms of reference substance solution(2.00 μg·mL-1) |
肌肽的提取率与样品预处理的温度有关。称取约10.00 g的牛肉样品5份，按“1.3.2”项方法进行处理，水浴温度分别为20、30、40、50、60 ℃，得到的提取液按“1.4.1”项下RP-HPLC色谱条件进样，计算肌肽提取率（图 3），结果表明，在40 ℃时肌肽提取率最高，因此实验条件选定40 ℃。
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图 3 不同提取温度下牛肉中肌肽的提取率 Fig.3 Extraction rates of carnosine in beef at different extraction temperatures |
取质量浓度为0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00、8.00 μg·mL-1的对照品溶液，按照“1.4”色谱条件依次进样分析，并进行线性关系、精密度、检测下限和定量下限的考察。每个浓度样品分别测定3次，取3次所得峰面积的平均值，以峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标建立肌肽的标准曲线。另取质量浓度为1.00 μg·mL-1的对照品溶液，照“1.4”项下色谱条件连续重复进样11次，测定峰面积，计算RSD，且以3倍和10倍基线噪声下的色谱峰所对应的浓度，通过试样来验证方法的检测下限和定量下限，结果见表 1。
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表 1 线性方程、相关系数、线性范围、检测下限、定量下限及重现性 Tab.1 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges, limits of detection, limits of quantification and reproducibility |
考虑到IEC（Dionex AminoPacTM PA-10）法分离的色谱峰的峰形有拖尾和基线漂移（见图 2-B），因此对其线性关系进行显著性检验，结果（表 2）表明，IEC（Dionex AminoPacTM PA-10）法的显著性检验t=70.65，用单侧检验，查表得t0.01（4）单侧=3.75，t =70.69 > > 3.75（t0.01（4）），所以对照品溶液的浓度与其对应的峰面积之间有显著的线性关系，可以采用IEC（Dionex AminoPacTM PA-10）法对样品进行分离。
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表 2 相关系数的显著性检验 Tab.2 Significance test of correlation coefficient |
精密称取牛肉10.00 g，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，考察流动相比例（±10%）及柱温变化（±5%）下2类仪器色谱行为的变化，每个条件各测试2次。结果表明，主峰都可以得到有效的分离，显示方法具有较好的耐用性。分3次对购自超市的牛肉按“1.3.2”项下条件制备供试品溶液，连续进样80多次测定，观察仪器色谱行为的变化。结果主峰都可以得到有效的分离，分离度在2.0以上，表明色谱柱承受力较好。
2.4 样品的测定及加样回收试验按照“1.3.2”项方法处理样品，按“1.4”的色谱条件进样分析，结果发现，采用RP-HPLC（Agilent TC-C18）和IEC（Dionex AminoPacTM PA-10）时样品分离效果较好，而采用IEC（Dionex CarboPacTM PA10）时分离效果不太好，杂质峰干扰严重，见图 4。后续试验采用Agilent TC-C18和Dionex AminoPacTM PA-10对样品进行分离。为了进一步验证方法的回收率，称取6份样品约10.00 g，分别加入适量储备液，按“1.3.2”下方法制备供试溶液，分别进RP-HPLC（Agilent TC-C18）和IEC（Dionex AminoPacTM PA-10）进行试验，测定加样回收率，结果见表 3。
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1.肌肽（carnosine） 图 4 样品稀释10倍后的Agilent TC-C18色谱图（A）和稀释20倍后的的Dionex CarboPacTM PA10（B）、Dionex AminoPacTM PA-10（C）色谱图 Fig.4 Chromatograms of Agilent TC-C18 after 10 times dilution(A), chromatograms of CarboPacTM PA10(B)and Dionex AmionPacTM PA-10(C)after 20 times dilution |
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表 3 加样回收率试验结果（n=6） Tab.3 Results of recovery rate test |
取13份牛肉样品，按“1.3.2”项方法处理后，分别用RP-HPLC和IEC分离测定，每个样品重复测定3次，取平均值。为检查测定值中是否存在异常值，将测定数据经过狄克逊（Dixon）检验法，剔除异常值后结果见表 4。由表 4可知，RP-HPLC法的RSD=1.2%（n=11），IEC法RSD=1.2%（n=11），表明2种方法的重复性良好，符合要求。
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表 4 牛肉中肌肽测定值 Tab.4 Measured results of carnosine in beef |
为比较2种检测方法的精密度是否有差异，对试验数据进行F双侧检验及F单侧检验，显著性水平为α=0.05，df1=10，df2=10及F 分布表，结果如表 5。
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表 5 F检验 Tab.5 F-test |
由检验结果知，按照α=0.05水准，P > 0.05，可认为2组数据的总体方差相等，两者的精密度无显著差异。
2.5.2 t 检验为比较2种试验方法的结果有无系统误差，对实验数据进行“ t 检验：双样本等方差假设”。根据显著性水平α=0.05，df1=10，df2=10及单侧t 分布表，结果见表 6。
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表 6 t检验 Tab.6 t-test |
由检验结果知，因为| t | > “t双尾临界”，“P（T < =t）双尾” < 0.05，所以2个平均值有显著差异；单侧检验时，t < 0，且| t | > “t单尾临界”，可判断RP-HPLC法数据的平均值较IEC法数据的平均值有显著减小。
3 结论采用RP-HPLC法和IEC法测定牛肉中肌肽的方法学考察结果表明，2种测定方法可靠。对2种方法测定结果的F 检验表明，精密度无差异，但t 检验（系统误差检验）发现存在显著差异，需要进一步探讨，以消除系统误差。
从色谱图可看出，IEC法杂质干扰较少，线性范围较宽，分析时间短，检测下限更低，可适用于基体复杂的样品检测，同时使用的流动相无毒，对检测人员跟环境友好。RP-HPLC法峰形对称，但检测时间相对略长，杂质峰明显，如果使用在复杂基体中的样品，有可能分离效果不好。
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