2019, Vol. 39 
藏药双花千里光（Senecio dianthus Franch.）为菊科千里光族（Senecioncea）的千里光属植物，产于西藏、云南等地，《藏药志》记载，此药具有消炎消肿、清热解毒等功效[1]，在藏区主要用于治疗眼结膜炎、疮疖痛肿、咽喉炎、上呼吸道感染等症[2]，近几年，部分藏族同胞还将双花千里光用于美容，且得到良好效果。千里光属的植物种类繁多，研究报道过的主要成分为呋喃雅槛蓝型倍半萜（furoeromophilanes），常用中药千里光还含有吡咯里西啶类生物碱（pyrrolizidinealk aloids），此外还有挥发油和黄酮类[3-6]。目前，关于用HPLC对藏药双花千里光的化学成分进行含量测定在国内外均少见报道。故本实验将采用HPLC对双花千里光中6个化学成分进行定量分析，为该药用植物的质量控制提供理论依据，以便更合理地开发和利用该药用植物。
1 仪器、试剂与材料 1.1 仪器安捷伦1260高效液相色谱仪，DAD检测器；安捷伦ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）；赛多利斯十万分之一电子分析天平；赛默飞世尔科技有限公司GenPure Pro超纯水机；赛多利斯移液枪。
1.2 试剂与材料对照品绿原酸、芦丁、烟花苷、紫云英苷、金丝桃苷、异槲皮苷均购于成都普思生物科技有限公司，纯度皆大于98.0%；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯；藏药双花千里光采自西藏拉萨市，由西藏自治区食品药品检验所副主任药师达娃卓玛鉴定为菊科千里光族千里光属的植物双花千里光。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱:安捷伦ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~2 min，0→16%A；2~6 min，16%A→15%A；6~8 min，15%A；8~13 min，15%A→20%A；13~16 min，20%A→25%A；16~19 min，25%A→20%A；19~26 min，20%A→30%A）；流速：1 mL·min-1；柱温：（30±0.8）℃；检测波长：360 nm；进样量均为20 μL。色谱图如图 1所示。
|
1.绿原酸（chlorogenic acid）2.芦丁（rutin）3.金丝桃苷（hyperoside）4.异槲皮苷（isoquercitrin）5.烟花苷（kaempferol-3-O-rutinoside）6.紫云英苷（astragalin） 图 1 混合对照品（A）、双花千里光样品（B）HPLC图 Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and Senecio dianthus Franch.(B) |
按2015年版《中华人民共和国药典》一部[7]，精密称取双花千里光样品粉末约1.0 g于圆底烧瓶中，加入70%乙醇水溶液30 mL，80 ℃左右加热回流2 h，放至室温后用中速滤纸过滤，滤液在50℃下浓缩为浸膏，用10%甲醇水溶液定容至100 mL量瓶中，摇匀后0.45 μm微孔滤膜过滤，作为双花千里光药材供试品溶液。
2.3 混合对照品溶液的制备精密称取对照品绿原酸12.5 mg、金丝桃苷9.0 mg、异槲皮苷10.2 mg、烟花苷9.78 mg、紫云英苷12.2 mg，置25 mL量瓶中，用10%甲醇水溶液溶解并定容到刻度，即得质量浓度分别为0.500、0.360、0.408、0.391、0.488 mg·mL-1的混合对照品溶液；芦丁9.0 mg用甲醇超声溶解后定容于25 mL量瓶中，即得0.360 mg·mL-1芦丁对照品溶液。
2.4 方法学考察 2.4.1 线性关系考察用移液枪吸取“2.3”项下混合对照品溶液和芦丁对照品溶液均0.4、1、2、3、4、5 mL，一一对应定容于10 mL量瓶中，分别进样20 μL，以混合对照品浓度（X，mg·mL-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果见表 1。
|
表 1 6个成分回归方程及线性范围 Tab.1 Regression equations and linear ranges of six components |
取“2.4.1”项下混合对照品溶液适量，按液相色谱条件连续进样5次。绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、烟花苷和紫云英苷峰面积的RSD（n=6）分别为1.5%、1.0%、1.7%、1.3%、1.6%、0.94%，说明仪器精密度良好。
2.4.3 重复性试验按“2.2”项下方法，平行制备供试品溶液5份，进样测定，记录待测成分峰面积，药材中绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、烟花苷和紫云英苷的含量分别为1.738%、1.231%、0.875%、1.196%、0.593%、1.302%，RSD分别为1.6%、1.6%、1.8%、1.2%、0.99%、0.61%。表明本实验重复性很好。
2.4.4 稳定性试验取1份双花千里光供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、20、24、32 h进样，记录6个成分峰面积，计算绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、烟花苷和紫云英苷峰面积的RSD分别为1.5%、1.4%、1.2%、1.4%、0.72%、1.0%，表明供试品溶液在32 h内稳定。
2.4.5 加样回收率试验精密称取已知6个成分含量的双花千里光药材粉末9份，每份约0.5 g，置100 mL圆底烧瓶中，分别精密加入“2.3”项下的混合对照品溶液和芦丁对照品溶液2、4、8 mL，每一体积取3份，按“2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项条件检测。结果绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、烟花苷和紫云英苷的平均回收率分别为99.0%、96.5%、95.7%、94.2%、92.5%、93.3%，RSD分别为1.1%、1.7%、1.5%、1.9%、1.5%、2.0%。
2.5 样品测定精密称取双花千里光粉末约1.0 g共3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液。在“2.1”项色谱条件下进样测定，得到绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、烟花苷和紫云英苷的峰面积值，计算含量，结果见表 2。
|
|
表 2 双花千里光中6个化学成分含量（%） Tab.2 The contents of six chemical components in Senecio dianthus Franch |
对千里光属植物化学成分的研究国内外已有一些报道[8-11]。该属植物主要含有倍半萜类、生物碱类、酚酸类、黄酮类、糖苷类、挥发油等化合物，其中酚酸类和黄酮类化合物生物活性显著[12]。本实验通过测定双花千里光中的绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、烟花苷和紫云英苷6个主要成分的含量，为进一步评价双花千里光的质量提供了客观指标。
3.2 检测波长的确定对6个化合物在分析时同时进行了全波长紫外扫描，结果绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、烟花苷和紫云英苷的λmax分别为325 nm，255和354 nm，254和354 nm，262和353 nm，265和347 nm，265和347 nm。波长为360 nm时各色谱峰分离度最高，同时可兼顾6个成分的最大吸收，且基线平稳，故以360 nm为检测波长。
3.3 提取方法和流动相的选择韩贺东等[13]已经证实用70%乙醇水溶液回流提取双花千里光，所得黄酮类化合物提取率高，同时参照2015年版《中华人民共和国药典》，最终采用70%乙醇水溶液作为提取溶剂，对双花千里光药材进行回流提取。选择流动相时，考虑到药材中化合物大多数为黄酮类，首先采用梯度洗脱程序，选用的流动相为甲醇-水，由于芦丁、金丝桃苷还有异槲皮苷的结构极为相似，并且金丝桃苷、异槲皮苷的不同之处只是在糖基部分羟基构型上，极性极为相似，很难分开，后改用乙腈-水、乙腈-0.4%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水等流动相，从峰分离情况、出峰的稳定性，以及其他因素考虑，最终选择乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。
4 小结参照2015年版《中华人民共和国药典》千里光含量测定方法和相关文献，对双花千里光植物所含化合物进行了含量测定。结果发现，6个成分中绿原酸的含量最高，为1.75%左右，芦丁的含量为1.26%，2个成分的质量分数总和占6个主要化合物总和的43.43%左右，金丝桃苷和异槲皮苷的含量稍低，分别为0.86%和1.20%，烟花苷和紫云英苷的含量分别为0.57%和1.29%。因为提取方法的不同，各个成分在含量上会有些许差异。2015年版《中华人民共和国药典》规定，按千里光干燥品计算，含金丝桃苷（C21H20O12）的总量不得少于0.030%。可见，藏药双花千里光金丝桃苷含量远大于《中华人民共和国药典》要求，为较优的非药典品种药材。本实验为双花千里光的进一步开发和药理作用研究奠定了基础。
| [1] |
中国科学院西北高原生物研究所.藏药志.植物药类[M].西宁: 青海人民出版社, 1991: 323 Northwest Plateau Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences.Tibetan Medicine.Botanicals[M].Xining: Qinghai People's Publishing House, 1991: 323 |
| [2] |
青海省药品检验所, 青海省藏医药研究所.中国藏药.第三卷[M].上海: 上海科学技术出版社, 1996: 280 Qinghai Provincial Institute of Drug Control, Qinghai Institute of Tibetan Medicine.Chinese Tibetan Medicine.Volume Ⅲ[M].Shanghai: Shanghai Scientific & Technical Publishers, 1996: 280 |
| [3] |
王晓玲, 梁思琦, 李文君, 等. 藏药双花千里光中绿原酸的分离纯化及结构鉴定[J]. 西南民族大学学报(自然科学版), 2016, 42(1): 52. WANG XL, LIANG SQ, LI WJ. Isolation and structure identification of chlorogenic acid from Senecio dianthus Franch[J]. J Southwest Univ Natl(Nat Sci), 2016, 42(1): 52. |
| [4] |
吴斌, 吴立军. 千里光属植物的化学成分研究进展[J]. 中国中药杂志, 2003, 28(2): 6. WU B, WU LJ. Research progress in chemical constituents of Senecio genus[J]. Chin J Tradit Chin Med, 2003, 28(2): 6. |
| [5] |
韩贺东, 胡海清, 李琰, 等. 双花千里光中一个新的艾里莫芬烷型倍半萜[J]. 中国中药杂志, 2013, 38(19): 3295. HAN HD, HU HQ, LI Y, et al. A new erimophenane sesquiterpene in Senecio dianthus Franch[J]. China J Tradit Chin Med, 2013, 38(19): 3295. |
| [6] |
梅莹, 黄帅, 陈才, 等. 双花千里光中黄酮类成分的研究[J]. 华西药学杂志, 2012, 27(5): 496. MEI Y, HUANG S, CHEN C, et al. Study on flavonoids in Senecio dianthus Franch[J]. West China J Pharm Sci, 2012, 27(5): 496. |
| [7] |
中华人民共和国药典2015年版.一部[S].2015: 33 ChP 2015.Vol Ⅰ[S].2015: 33 |
| [8] |
赵雪巍, 刘培玉, 刘丹, 等. 黄酮类化合物的构效关系研究进展[J]. 中草药, 2015, 46(21): 3264. ZHAO XW, LIU PY, LIU D, et al. Research progress in structure-activity relationship of flavonoids[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2015, 46(21): 3264. DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2015.21.025 |
| [9] |
李艳辉, 格桑索朗, 阿萍, 等. 双花千里光花精油化学成分的GC/MS分析[J]. 分析试验室, 2006, 25(7): 42. LI YH, Ge-Sang-Suo-Lang, A P, et al. GC/MS analysis of chemical constituents of Senecio dianthus Franch[J]. Chin J Anal Lab, 2006, 25(7): 42. DOI:10.3969/j.issn.1000-0720.2006.07.011 |
| [10] |
蒋娅兰, 毋福海, 黄芳, 等. 高效液相色谱-串联质谱法同时测定山楂中6个黄酮类功效成分[J]. 药物分析杂志, 2018, 38(7): 1139. JIANG YL, WU FH, HUANG F, et al. Simultaneous determination of six flavonoids in hawthorn by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chin J Pharm Anal, 2018, 38(7): 1139. |
| [11] |
ARCINIEGAS A, GONZALEZ K, PEREZ-CASTORENA AL, et al. Seco-eremophiladiolides and eremophilane glucosides from Pittocaulon velatum[J]. J Nat Prod, 2011, 74(7): 1584. DOI:10.1021/np200188w |
| [12] |
黄帅.四种药用植物的化学成分及生物活性研究[D].成都: 西南交通大学, 2013 HUANG S.Chemical Constituents and Biological Activities of Four Medicinal Plants[D].Chengdu: Southwest Jiaotong University, 2013 |
| [13] |
韩贺东, 胡海清, 林燕, 等. 双花千里光总黄酮的提取工艺优化及其抗氧化活性[J]. 食品与发酵工业, 2013, 39(7): 232. HAN HD, HU HQ, LIN Y, et al. Optimization of extraction process and antioxidant activity of total flavonoids from Senecio dianthus Franch[J]. Food Ferment Ind, 2013, 39(7): 232. |